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目的
构建艰难梭菌二元毒素A、B全长序列的原核表达载体，在体外诱导表达可溶性重组蛋白His-CdtA和His-CdtB，利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白，用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，分析His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的免疫原性。然后用产二元毒素的艰难梭菌细胞悬液经灌胃感染免疫重组蛋白的实验组和PBS对照组小鼠，比较免疫后的实验组与对照组PBS小鼠的病态活动情况及肠道组织病理学改变，评价用纯化的重组蛋白免疫小鼠后所产生的抗体对小鼠是否具有保护作用，为今后进行艰难梭菌二元毒素A、B重组蛋白疫苗和实验诊断研究提供初步实验基础。
方法
（1）PCR扩增出二元毒素A、B的全长序列cdtA、cdtB，分别双酶切后与pET-28b质粒载体连接，导入E.coliBL21（DE3）感受态细胞，构建pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB原核表达载体。
（2）经测序验证插入序列无基因突变的克隆株E.colipET-28b-cdtA、E.colipET-28b-cdtB大量增菌，至培养物在600nm处吸光度为0.6-0.8（对数生长期）时，调整培养温度为25℃、30℃、37℃，IPTG诱导剂浓度为0、0.5、1.0、1.5mmoL/L，160rpm振荡培养12h，探索His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的可溶性表达最佳诱导条件。
（3）在可溶性表达的最佳诱导条件下大量诱导His-CdtA和His-CdtB重组蛋白表达，利用AKTA蛋白纯化仪及His-trapHP镍柱，根据亲和层析法纯化重组蛋白，进行westernblot鉴定其特异性。
（4）纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白分别免疫6周龄Balb/c小鼠，免疫3次后取小鼠血清，检测小鼠血清抗体滴度。
（5）PBS对照组小鼠以及用纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白分别免疫3次后的实验组小鼠，用109CFU/mL产二元毒素的艰难梭菌标准菌株ATCCBAA-1870细胞悬液灌胃，观察实验组和PBS对照组的小鼠病态活动情况、粪便性状及肠道组织病理改变。
结果
（1）成功构建pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB原核表达载体，经测序验证插入序列无基因突变。
（2）当E.colipET-28b-cdtA培养物在600nm处吸光度为0.6时调整培养温度为37℃、IPTG浓度为0、160rpm振荡培养12h，细菌破碎产物上清在45000Mr附近有大量蛋白表达，与His-CdtA的理论值53000Mr接近。
（3）当E.colipET-28b-cdtB培养物在600nm处吸光为0.6时调整培养温度为25℃、IPTG浓度为1.5mM，160rpm振荡培养12h，细菌破碎产物上清在100000Mr处有大量蛋白表达，与His-CdtB的理论值98000Mr接近。
（4）His-CdtA的最佳纯化条件为：10mM的咪唑洗脱杂蛋白后200mM的咪唑洗脱目的蛋白。His-CdtB的最佳纯化条件为：20mM的咪唑洗脱杂蛋白后200mM的咪唑洗脱目的蛋白。
（5）纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白经westernblot鉴定在其理论值大小附近有特异性条带而pET-28b空载体表达的蛋白对照无此现象。
（6）纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白免疫小鼠后，小鼠血清产生的抗体滴度分别达到了1︰104和1︰105。
（7）重组蛋白免疫后的实验组小鼠和PBS对照组小鼠经产二元毒素艰难梭菌细胞悬液灌胃后，PBS组小鼠当天全部出现了蜷缩、立毛和腹泻的病态活动情况，这种状态持续了3天；而重组蛋白His-CdtA和His-CdtB免疫后的实验组小鼠仅在灌胃当天出现这样的情况，第二天全部恢复正常。解剖小鼠发现PBS组小鼠肠道表面充血明显，而实验组小鼠肠道表面未见明显充血；肠道组织病理切片结果显示PBS组小鼠肠道组织黏膜下充血水肿、出现明显的炎症细胞浸润，病变与人类CDI相似；而实验组小鼠肠道组织肌层和黏膜层完整、仅出现少量的炎症细胞浸润，病变不明显。
结论
（1）成功构建艰难梭菌二元毒素A、B的全长序列的原核表达载体pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB，纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白为分析艰难梭菌二元毒素毒理及诊断研究奠定实验基础。
（2）经纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白免疫小鼠后分别产生了1︰104和1︰105高滴度的抗体，说明重组的二元毒素A、B蛋白具有很好的免疫原性。
（3）免疫了His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的小鼠经产二元毒素艰难梭菌细胞悬液灌胃攻击后产生病态活动情况持续时间明显比对照的PBS组短，解剖后肠道表面情况及组织病理切片结果几乎与正常小鼠相似，说明小鼠免疫了His-CdtA和His-CdtB重组蛋白后产生的相应抗体对小鼠有一定保护作用。
构建艰难梭菌二元毒素A、B全长序列的原核表达载体，在体外诱导表达可溶性重组蛋白His-CdtA和His-CdtB，利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白，用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，分析His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的免疫原性。然后用产二元毒素的艰难梭菌细胞悬液经灌胃感染免疫重组蛋白的实验组和PBS对照组小鼠，比较免疫后的实验组与对照组PBS小鼠的病态活动情况及肠道组织病理学改变，评价用纯化的重组蛋白免疫小鼠后所产生的抗体对小鼠是否具有保护作用，为今后进行艰难梭菌二元毒素A、B重组蛋白疫苗和实验诊断研究提供初步实验基础。
方法
（1）PCR扩增出二元毒素A、B的全长序列cdtA、cdtB，分别双酶切后与pET-28b质粒载体连接，导入E.coliBL21（DE3）感受态细胞，构建pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB原核表达载体。
（2）经测序验证插入序列无基因突变的克隆株E.colipET-28b-cdtA、E.colipET-28b-cdtB大量增菌，至培养物在600nm处吸光度为0.6-0.8（对数生长期）时，调整培养温度为25℃、30℃、37℃，IPTG诱导剂浓度为0、0.5、1.0、1.5mmoL/L，160rpm振荡培养12h，探索His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的可溶性表达最佳诱导条件。
（3）在可溶性表达的最佳诱导条件下大量诱导His-CdtA和His-CdtB重组蛋白表达，利用AKTA蛋白纯化仪及His-trapHP镍柱，根据亲和层析法纯化重组蛋白，进行westernblot鉴定其特异性。
（4）纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白分别免疫6周龄Balb/c小鼠，免疫3次后取小鼠血清，检测小鼠血清抗体滴度。
（5）PBS对照组小鼠以及用纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白分别免疫3次后的实验组小鼠，用109CFU/mL产二元毒素的艰难梭菌标准菌株ATCCBAA-1870细胞悬液灌胃，观察实验组和PBS对照组的小鼠病态活动情况、粪便性状及肠道组织病理改变。
结果
（1）成功构建pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB原核表达载体，经测序验证插入序列无基因突变。
（2）当E.colipET-28b-cdtA培养物在600nm处吸光度为0.6时调整培养温度为37℃、IPTG浓度为0、160rpm振荡培养12h，细菌破碎产物上清在45000Mr附近有大量蛋白表达，与His-CdtA的理论值53000Mr接近。
（3）当E.colipET-28b-cdtB培养物在600nm处吸光为0.6时调整培养温度为25℃、IPTG浓度为1.5mM，160rpm振荡培养12h，细菌破碎产物上清在100000Mr处有大量蛋白表达，与His-CdtB的理论值98000Mr接近。
（4）His-CdtA的最佳纯化条件为：10mM的咪唑洗脱杂蛋白后200mM的咪唑洗脱目的蛋白。His-CdtB的最佳纯化条件为：20mM的咪唑洗脱杂蛋白后200mM的咪唑洗脱目的蛋白。
（5）纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白经westernblot鉴定在其理论值大小附近有特异性条带而pET-28b空载体表达的蛋白对照无此现象。
（6）纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白免疫小鼠后，小鼠血清产生的抗体滴度分别达到了1︰104和1︰105。
（7）重组蛋白免疫后的实验组小鼠和PBS对照组小鼠经产二元毒素艰难梭菌细胞悬液灌胃后，PBS组小鼠当天全部出现了蜷缩、立毛和腹泻的病态活动情况，这种状态持续了3天；而重组蛋白His-CdtA和His-CdtB免疫后的实验组小鼠仅在灌胃当天出现这样的情况，第二天全部恢复正常。解剖小鼠发现PBS组小鼠肠道表面充血明显，而实验组小鼠肠道表面未见明显充血；肠道组织病理切片结果显示PBS组小鼠肠道组织黏膜下充血水肿、出现明显的炎症细胞浸润，病变与人类CDI相似；而实验组小鼠肠道组织肌层和黏膜层完整、仅出现少量的炎症细胞浸润，病变不明显。
结论
（1）成功构建艰难梭菌二元毒素A、B的全长序列的原核表达载体pET-28b-cdtA和pET-28b-cdtB，纯化的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白为分析艰难梭菌二元毒素毒理及诊断研究奠定实验基础。
（2）经纯化后的His-CdtA和His-CdtB重组蛋白免疫小鼠后分别产生了1︰104和1︰105高滴度的抗体，说明重组的二元毒素A、B蛋白具有很好的免疫原性。
（3）免疫了His-CdtA和His-CdtB重组蛋白的小鼠经产二元毒素艰难梭菌细胞悬液灌胃攻击后产生病态活动情况持续时间明显比对照的PBS组短，解剖后肠道表面情况及组织病理切片结果几乎与正常小鼠相似，说明小鼠免疫了His-CdtA和His-CdtB重组蛋白后产生的相应抗体对小鼠有一定保护作用。