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胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是最常见的恶性原发脑肿瘤,其进展迅速、复发率高,患者5年生存率仅为6.8%。GBM患者预后不佳的主要原因是在手术、放疗和化疗多种模式治疗后,部分肿瘤细胞能够始动肿瘤复发。这些能始动肿瘤复发的细胞被称为胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSCs）,它们优先驻留在血管周围微环境中,并在GBM特有的侵袭性生长中发挥关键作用。尽管GSCs在GBM中的比例极低,但GBM中的GSCs可以驱动肿瘤形成、促进肿瘤自我更新。GSCs恶性生物学行为及分子机制的深入研究,对GBM患者的治疗及预后至关重要。Rho GTPases家族成员控制着广泛的关键细胞功能,对GBM的侵袭和迁移起着重要作用。它们的功能被三种蛋白精细地调控,鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）,GTPase激活蛋白（GAP）和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（GDIs）。Rho GTPases以活性GTP结合或非活性GDP结合状态存在。Rho GEFs促进GDP与GTP的相互转换,从而激活Rho GTPases,并最终调控细胞的增殖、分化和运动等众多反应。我们对Rho GEFs功能异常对人类疾病的作用的了解有限,对Rho GEFs的功能和调节的全面理解对于进一步理解GEFs家族基因如何促进异常信号和疾病是至关重要的。近年研究发现Rho GTPases及其上游调节因子或下游效应因子还参与肿瘤干细胞的转化、迁移、侵袭和肿瘤发生,被认为是肿瘤治疗的潜在靶点。SGEF（SH3-containing Guanine Nucleotide Exchange Factor）是一种功能未知的Rho GEF,通过数据库我们发现其与GBM患者的预后负相关且在GSCs中高表达。然而尚不清楚SGEF在维持GSCs“干性”中的作用。本文探讨了SGEF对GSCs“干性”的维持及机制研究。研究的主要结果和意义如下:一.筛选SGEF并研究其在胶质母细胞瘤中的表达1.1分析GEO:GDS3885里Rho GEF家族基因的差异表达,发现ARHGEF26（SGEF）、ARHGEF6、PREX1、PREX2、DOCK4基因在GSCs中高表达。1.2通过CCGA数据库分析候选基因与生存预后的关系,发现5个候选基因只有SGEF与GBM患者的生存预后呈负相关。1.3在TCGA和Gravendeel胶质瘤数据库里分析SGEF在GBM肿瘤与瘤旁组织中的表达情况,发现SGEF在肿瘤中的表达明显高于瘤旁组织,组织样本免疫组化染色结果显示,GBM中SGEF蛋白表达水平明显高于瘤旁组织。我们通过Western blot检测10例新鲜GBM临床样本中SGEF蛋白表达水平,与免疫组化染色结果一致,SGEF在肿瘤中的表达明显高于瘤旁组织。1.4流式检测结果显示,SGEF在CD133阳性的肿瘤细胞中表达更高。1.5将GSCs用DMEM完全培养基培养10天,诱导GSCs分化,通过Western blot检测发现,随着GSCs的诱导分化,神经元分化标记物GFAP表达增高,干细胞标志物SOX2表达降低,SGEF的表达也降低。1.6 GBM组织样本免疫荧光染色显示,SGEF与GSCs干细胞标记物SOX2和Olig2存在共定位,并且免疫荧光双染胶质瘤干细胞球,显示SGEF与GSCs干细胞标记物SOX2和CD133存在共定位。二.SGEF增强胶质母细胞瘤“干性”表型2.1通过干细胞极限稀释实验和干细胞成球实验证明,敲低SGEF明显抑制GSCs的自我更新。而过表达SGEF明显促进GSCs的自我更新。2.2体内试验结果表明,敲低GSCs中SGEF的表达后小鼠颅内原位移植瘤的成瘤能力明显降低,小鼠生存时间更长。2.3免疫荧光检测显示,敲低SGEF的表达导致小鼠颅内原位移植瘤中cleaved caspase 3阳性细胞数显著增加,证明敲低SGEF后促进肿瘤细胞的凋亡。敲低SGEF的表达导致小鼠颅内原位移植瘤中Ki67阳性细胞数减少,证明敲低SGEF后肿瘤细胞的增殖能力减弱。2.4 Transwell迁移实验显示,过表达SGEF后促进GBM细胞的迁移。敲低SGEF后抑制GBM细胞的迁移。2.5 Transwell侵袭实验显示,过表达SGEF显著促进GBM细胞的侵袭。敲低SGEF显著抑制GBM细胞的侵袭。三.SGEF调控胶质母细胞瘤“干性”的分子机制3.1 Western blot检测结果表明,过表达SGEF后SOX2蛋白水平明显升高,敲低SGEF后SOX2蛋白水平显著降低。q RT-PCR结果显示,过表达和敲低SGEF后,SOX2 m RNA水平没有变化,这说明SGEF可能通过非转录水平调控SOX2的表达。3.2通过Co-IP实验,证实了SGEF与SOX2在GSCs中存在相互作用。3.3免疫荧光检测发现SGEF与SOX2在GSCs中存在共表达。3.4蛋白质半衰期检测结果显示,敲低SGEF后SOX2的半衰期明显缩短,过表达SGEF后SOX2的半衰期明显延长。3.5用蛋白酶体阻断剂（MG132）阻断蛋白酶体途径蛋白降解后,通过Western blot检测显示,MG132能部分回复敲低SGEF对SOX2表达的降解。3.6 Ni-NTA Pull Down结果显示,过表达SGEF后SOX2蛋白泛素化明显下降,敲低SGEF后SOX2蛋白泛素化明显增强。在本研究中,我们可以得出以下结论:（1）SGEF在胶质母细胞瘤中高表达,并与胶质母细胞瘤“干性”相关。（2）SGEF增强胶质母细胞瘤“干性”表型。（3）SGEF通过抑制SOX2发生泛素化降解来维持其稳定性进而维持胶质母细胞瘤“干性”表型。