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引言:胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一,约占颅内肿瘤的40%。脑恶性胶质瘤的标准治疗包括最大限度的外科手术切除,并辅以化疗药物替莫唑胺（temozolomide,TMZ）进行化疗和放疗。离子稳态和细胞体积调节在许多细胞功能中发挥重要作用,包括调节细胞内代谢、上皮间运输、细胞迁移、细胞生长和细胞死亡。细胞内K+稳态被认为是调节凋亡程序caspase通路激活和凋亡核酸酶功能的重要调节因子。早期研究强烈表明钾离子和氯离子通道以及离子转运体与胶质瘤的化学耐药性有关。离子转运体NKCC1（Na+-K+-2Cl-cotransporter isoform 1,钠-钾-2氯共转运体1）隶属于阳离子SLC12A2家族,在神经元,神经胶质细胞中均有表达。在生理情况下,NKCC1介导Na+,K+,Cl-流入细胞并伴随水分子的转运,在调节细胞内离子稳态及细胞体积稳态中发挥重要作用。近年来,离子转运体在神经科学和脑胶质瘤研究领域中受到广泛关注。对肿瘤基因组图谱和中国胶质瘤基因组图谱数据集的生物信息学分析和免疫印迹分析表明,SLC12A2基因及其编码的NKCC1蛋白在II-IV级胶质瘤中大量表达。NKCC1定位于胶质瘤细胞前缘,调节胶质瘤细胞迁移浸润时的胞内离子浓度梯度。胶质瘤细胞应对化疗药物替莫唑胺诱导的离子紊乱以及凋亡性细胞皱缩时激活NKCC1,调节细胞体积和细胞内离子浓度,产生化疗药物替莫唑胺抵抗。在本研究中,我们使用两种小鼠颅内同基因胶质瘤细胞系GL26和SB28-GFP探讨了NKCC1在应对化疗药物替莫唑胺干预时对脑胶质瘤细胞K+内流和增殖的作用,并对新型的NKCC1的抑制剂,布美他尼的衍生物STS66(3-（丁胺基）-2-苯氧-5-[（2,2,2-三氟乙胺甲基]苯磺酰胺）在不同浓度下对阻断NKCC1活性的效应和阻碍胶质瘤细胞的增殖进行了研究,并与NKCC1抑制剂布美他尼进行了疗效比较。方法:在GL26和SB28-GFP两种胶质瘤细胞系中通过ICR8000（Ion Channel Reader8000,离子通道阅读器）在不同渗透压以及不同浓度的NKCC1抑制剂存在条件下测定NKCC1介导的铷离子（Rb+）内流来反映的NKCC1活性以及药物干预时的最佳浓度。通过免疫印迹法检测NKCC1蛋白,上游激酶WNK1（Kinase with no lysine（K）,赖氨酸缺乏蛋白激酶1）-SPAK（Ste20-related proline-alanine-rich kinase,Ste20相关的脯氨酸富丙氨酸激酶）/OSR1（oxidative stress-responsive kinase-1,氧化应激激酶1）的表达和激活,以及AKT/ERK-m TOR（mammalian target of rapamycin,哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白）信号通路蛋白表达和激活。采用Brd U（Bromodeoxyuridine,溴脱氧尿苷）掺入法、MTT（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide）增殖法测定胶质瘤细胞的增殖,流式细胞术进行细胞周期分析。在化疗药物替莫唑胺干预组和对照组中,测定STS66和布美他尼对胶质瘤细胞Rb+内流和生长的影响。结果:Rb+（K+）内流实验结果显示,10μM的布美他尼在等渗和高渗条件下能显著降低GL26和SB28-GFP两种胶质瘤细胞总的和NKCC1介导的Rb+内流,在浓度大于10μM时没有检测到额外的抑制作用。相比之下,新型的NKCC1抑制剂STS66对总的和NKCC1介导的Rb+内流抑制随着浓度的增加而增强,其最大作用浓度在40-60μM之间。慢性干预48小时结果显示,STS66抑制GL26胶质瘤细胞中总的Rb+内流和NKCC1介导的Rb+内流。TMZ+STS66联合治疗显著降低了GL26细胞中NKCC1介导的Rb+摄取,在等渗条件下降低了约60.0%（p＜0.0001）,在高渗条件下降低了约44.8%（p＜0.0001）。在SB28-GFP胶质瘤细胞中也表现出类似的效应。此外,布美他尼和STS66均表现出抑制化疗药物替莫唑胺介导的WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1蛋白通路的表达和激活。在GL26细胞中,TMZ干预48小时抑制Brd U掺入（p＜0.01）,但在SB28-GFP没有产生效应。胶质瘤细胞在BMT、STS66（10μM）单独干预或联合TNMZ干预48 h均不能抑制GL26或SB28-GFP细胞的增殖。而STS66（60μM）单独或联合TMZ均能显著抑制Brd U在GL26和SB28-GFP细胞中的掺入。此外,STS66在单一干预治疗时可显著抑制GL26和SB28-GFP胶质瘤细胞的增殖和诱导细胞周期G0/G1期阻滞,联合化疗药物替莫唑胺干预时对胶质瘤细胞的增殖、细胞周期的阻滞和AKT/ERK信号通路的抑制达到最大效应。结论:通过对GL26和SB28-GFP两种胶质瘤细胞的研究表明,新型的布美他尼衍生物,NKCC1的抑制剂STS66在抑制WNK1-SPAK/OSR1-NKCC1通路,抑制胶质瘤细胞生长方面比布美他尼更有效,这种抑制效应在一定程度上是通过抑制NKCC1介导的K+内流产生的。在STS66联合替莫唑胺干预治疗时,通过抑制AKT/ERK信号通路和细胞周期的进展,降低胶质瘤细胞的生长,这在一定程度上可能为胶质瘤的治疗提供新的治疗策略。