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在全世界范围内,肝癌是第五大常见的恶性肿瘤,其致死率在各类癌症中排名第三位[1],严重危害人类的生命健康。最近几年,手术和干预治疗取得很大进展,但由于肝癌的反复发生及转移使得肝癌病人的预后仍然较差。因此探究肝癌发生转移的机制对改善临床治疗效果具有至关重要的意义。GPM6A主要在神经元细胞中高表达,尤其在海马体、大脑皮层、前脑、小脑和视网膜中高表达[2]。以往的研究报道表明GPM6A参与轴突生长、神经元的分化和突触的形成[3-7]。GPM6A在肿瘤中的作用仅有一篇报道:CharfiC等人的研究首次表明GPM6A在淋巴瘤细胞中作为致癌基因发挥作用[8]。但GPM6A在肝癌中的作用未见相关报道。我们通过生物信息学分析发现GPM6A在肝癌中呈现低表达,并且其低表达与肝癌病人的不良预后相关,这表明异常表达的GPM6A与肝癌的发生发展相关。我们用TargetScan数据库预测发现GPM6AmRNA3’-UTR第155-162bp上有miR-520a-3p的结合位点,并且miR-520a-3p的表达水平在肝癌中显著增加,表明miR-520a-3p可能参与调控GPM6A的表达,进而促进肝癌的进展。本研究旨在探究miR-520a-3p对GPM6A表达的调控作用,以及miR-520a-3p和GPM6A在肝癌中的作用,以期为肝癌研究提供新的理论基础和治疗靶点。
为了验证GPM6A是否在肝癌中表达异常,我们利用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测了GPM6A在19对肝癌组织及肝癌细胞中的表达情况,实验结果显示肝癌组织和肝癌细胞中GPM6A的表达量显著低于其在正常肝组织和肝细胞中的表达量。我们又用荧光定量PCR检测了miR-520a-3p在肝癌组织及细胞中的表达情况,结果发现miR-520a-3p在肝癌组织和肝癌细胞中呈现高表达。接着我们对肝癌组织中miR-520a-3p的表达水平与GPM6ARNA的表达水平进行了Pearson相关性分析,分析结果表明miR-520a-3p的表达与GPM6ARNA的表达呈负相关的关系,这表明miR-520a-3p与GPM6A之间很可能存在相互作用关系。MicroRNA对目的基因表达调控最为常见的作用机制是通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合,降低靶基因mRNA的水平,在转录后水平对靶基因进行调控。为了证实miR-520a-3p是否通过靶向GPM6A3’-UTR来调控其表达,我们将含有野生型和突变型miR-520a-3p结合位点的GPM6A3’-UTR片段,分别构建到质粒中,做了双荧光素酶报告基因实验,实验数据显示miR-520a-3p被其抑制剂inhibitor抑制以后,插入野生型GPM6A3’-UTR片段的质粒表达活性明显增加,但不影响插入突变型GPM6A3’-UTR片段的质粒表达活性,这表明miR-520a-3p可以通过作用于GPM6A的3’-UTR来调控其mRNA的表达。此外我们的实验结果还发现miR-520a-3p被其抑制剂miR-520a-3pinhibitor抑制以后,无论在蛋白水平还是RNA水平,肝癌细胞中GPM6A的表达量均发生显著上升,以上结果证实miR-520a-3p通过作用于GPM6A3’-UTR来下调GPM6A的表达。为了探究GPM6A和miR-520a-3p在肝癌细胞中的作用,我们分别采用Transwell实验及划痕实验检测了GPM6A以及miR-520a-3p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,实验数据表明过表达GPM6A或者抑制miR-520a-3p都会抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力。在肝癌细胞中过表达miR-520a-3p可以下调GPM6A的表达,进而促进肝癌细胞迁移和侵袭能力,过表达miR-520a-3p同时过表达GPM6A能够逆转miR-520a-3p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的促进作用,这说明miR-520a-3p可以通过靶向GPM6A来促进肝癌细胞的迁移和侵袭。
综上所述,我们的研究表明:miR-520a-3p通过靶向GPM6AmRNA的3’-UTR下调GPM6A的表达,进而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。
为了验证GPM6A是否在肝癌中表达异常,我们利用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测了GPM6A在19对肝癌组织及肝癌细胞中的表达情况,实验结果显示肝癌组织和肝癌细胞中GPM6A的表达量显著低于其在正常肝组织和肝细胞中的表达量。我们又用荧光定量PCR检测了miR-520a-3p在肝癌组织及细胞中的表达情况,结果发现miR-520a-3p在肝癌组织和肝癌细胞中呈现高表达。接着我们对肝癌组织中miR-520a-3p的表达水平与GPM6ARNA的表达水平进行了Pearson相关性分析,分析结果表明miR-520a-3p的表达与GPM6ARNA的表达呈负相关的关系,这表明miR-520a-3p与GPM6A之间很可能存在相互作用关系。MicroRNA对目的基因表达调控最为常见的作用机制是通过与靶基因mRNA的3’-UTR结合,降低靶基因mRNA的水平,在转录后水平对靶基因进行调控。为了证实miR-520a-3p是否通过靶向GPM6A3’-UTR来调控其表达,我们将含有野生型和突变型miR-520a-3p结合位点的GPM6A3’-UTR片段,分别构建到质粒中,做了双荧光素酶报告基因实验,实验数据显示miR-520a-3p被其抑制剂inhibitor抑制以后,插入野生型GPM6A3’-UTR片段的质粒表达活性明显增加,但不影响插入突变型GPM6A3’-UTR片段的质粒表达活性,这表明miR-520a-3p可以通过作用于GPM6A的3’-UTR来调控其mRNA的表达。此外我们的实验结果还发现miR-520a-3p被其抑制剂miR-520a-3pinhibitor抑制以后,无论在蛋白水平还是RNA水平,肝癌细胞中GPM6A的表达量均发生显著上升,以上结果证实miR-520a-3p通过作用于GPM6A3’-UTR来下调GPM6A的表达。为了探究GPM6A和miR-520a-3p在肝癌细胞中的作用,我们分别采用Transwell实验及划痕实验检测了GPM6A以及miR-520a-3p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,实验数据表明过表达GPM6A或者抑制miR-520a-3p都会抑制肝癌细胞的侵袭、迁移能力。在肝癌细胞中过表达miR-520a-3p可以下调GPM6A的表达,进而促进肝癌细胞迁移和侵袭能力,过表达miR-520a-3p同时过表达GPM6A能够逆转miR-520a-3p对肝癌细胞迁移和侵袭能力的促进作用,这说明miR-520a-3p可以通过靶向GPM6A来促进肝癌细胞的迁移和侵袭。
综上所述,我们的研究表明:miR-520a-3p通过靶向GPM6AmRNA的3’-UTR下调GPM6A的表达,进而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。