【摘 要】
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黑色素瘤是人和动物常发生于皮肤的一种侵袭性恶性肿瘤,有的动物如牛还见于内脏器官。肿瘤的生长发育依赖于生长因子及其受体信号对细胞周期的调节。IGF-1在肿瘤细胞中表达上调,参与肿瘤的发生和发展。本研究旨在筛选和纯化IGF-1单域抗体,并对其在检测方面的应用和在黑色素瘤细胞中的功能进行研究,为揭示IGF单域抗体的功能提供依据。1.本研究使用IGF-1蛋白对羊驼源黑色素瘤细胞的单域抗体噬菌体文库进行淘筛
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黑色素瘤是人和动物常发生于皮肤的一种侵袭性恶性肿瘤,有的动物如牛还见于内脏器官。肿瘤的生长发育依赖于生长因子及其受体信号对细胞周期的调节。IGF-1在肿瘤细胞中表达上调,参与肿瘤的发生和发展。本研究旨在筛选和纯化IGF-1单域抗体,并对其在检测方面的应用和在黑色素瘤细胞中的功能进行研究,为揭示IGF单域抗体的功能提供依据。1.本研究使用IGF-1蛋白对羊驼源黑色素瘤细胞的单域抗体噬菌体文库进行淘筛,对淘筛得到的菌株进行酶联免疫吸附测定,挑选阳性单克隆菌株,进行测序确定IGF-1单域抗体菌株。2.根据IGF-1单域抗体的序列构建原核表达质粒,转化至BL21感受态细胞中,经菌液PCR检测并测序验证;进行小剂量诱导表达和纯化后,Western Blot检测特异性条带,ELISA检测其亲和性,表明成功构建IGF-1单域抗体表达质粒。对IGF-1单域抗体进行蛋白纯化,经SDS-PAGE和Western Blot检测,确定为IGF-1单域抗体。3.将IGF-1单域抗体作为一抗,应用于免疫组织化学中,在胞核中能检测到细胞内IGF-1的免疫阳性信号;将其应用于Western Blot中,在总蛋白中可见特异的IGF-1阳性条带,说明该抗体可以通过上述方法检测组织细胞内的抗原。4.将IGF-1单域抗体添加入黑色素瘤B16细胞培养基中,并使用CCK-8和划痕愈合法分别检测IGF-1单域抗体在不同时间对B16细胞增殖和迁移的影响及其可能的机制,试验结果发现,IGF-1单域抗体结合细胞中IGF-1通过调控RAS、ERK、RAF的表达对B16细胞的增殖和迁移具有一定的抑制作用。结论:本试验纯化得到的IGF-1单域抗体可应用于免疫印迹与免疫组织化学技术,用来检测细胞中IGF-1的表达及定位,IGF-1单域抗体能够抑制B16细胞的增殖和迁移,为黑色素瘤的临床诊疗提供了新的理论依据。
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