农杆菌介导LEA基因转化大豆的初步研究

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LEA(lateembryogenesisabundant)蛋白是在植物发育晚期种子大量积累的一类蛋白质。此外,在受干旱、盐、低温胁迫的植物营养组织中,这种蛋白质也可被诱导表达。因此,LEA蛋白是与植物细胞抗逆保护作用密切相关的蛋白。在植物转基因的这一领域,大豆是较难转化的作物之一,这是由于大豆组织培养再生困难,可重复性差,基因型之间差异大,遗传转化体系是完全根据大豆的基因型所建立的。本试验通过大豆子叶节器官发生途径的再生系统,选用我国栽培大豆再生频率高的3个基因型,并对影响再生频率和农杆菌介导的遗传转化系统的主要因素进行了优化,建立了一个适于农杆菌转化的大豆子叶节高效受体系统,并在此基础上进行了LEA基因的初步遗传转化研究。   首先用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切将pROKⅡ-LEA质粒上的P35S-LEA-Tnos完整表达框切下,并插入到具有相同酶切位点的pCAMBIA1301植物表达载体上,构建了pCAM-LEA植物表达载体。该载体上除了目的基因外,还具有潮霉素抗性基因和GUS报告基因。   为了建立有效的潮霉素筛选体系,将农杆菌浸染的半片种子在共培养基上共培养3~5d后,在无筛选剂的培养基上恢复培养7d,然后放在含有不同浓度潮霉素的筛选培养基上进行筛选。实验结果表明,最适潮霉素浓度为10mg/L。   研究了不同浓度的羧苄青霉素和头孢霉素对不定芽分化的影响,结果表明在0~300mg/L之间对大豆子叶节的生长以及不定芽的分化无较大的影响,在外植体与农杆菌共培养后,添加250mg/L的羧苄青霉素和头孢霉素可有效抑制农杆菌的生长,一般8d更换一次培养基。   农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中,对共培养后的大豆子叶节组织进行了GUS瞬时表达检测,根据GUS瞬时表达率的高低,决定侵染和共培养的最适时间分别为30min和3d。   采用PCR方法和GUS组织化学方法对转基因的植株进行了鉴定,结果表明,在合丰25和吉林小豆两个品种中分别获得转基因植株6株和3株,转化效率分别为0.86%和1.25%。
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