论文部分内容阅读
小麦纹枯病（Rhizotonia cerealis van der Hoeven apud.Boerema & Verhoeven）,主要是由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis vander hoeven）和立枯丝核菌（Rhizocton solani Kuha）引起的一种土传真菌病害,在世界范围内分布甚广。中国是小麦纹枯病发生和危害较为严重的国家。几十年来,国内外学者己就纹枯病病原、发生、危害、防治途径和方法以及小麦种质资源抗性筛选等方面开展研究,并取得一定进展。但与日趋严重的病害形势相比,研究工作还显得不够,特别是抗病育种研究进展缓慢。对抗小麦纹枯病基因工程的研究,目前的主要障碍之一是缺乏免疫或稳定的高抗抗源。因此,筛选抗小麦纹枯病的有效防卫基因作为纹枯病的高抗抗源具有十分重要的意义。本研究即以抗纹枯病小麦（Triticum aestivum Linn.）山农0431为实验材料,利用半定量RT-PCR的方法筛选病原诱导的下游病程相关基因（pathogenesis-related gene,PR gene）,并结合体外抑菌实验初步确定所筛选基因表达蛋白对小麦纹枯病菌的抑菌效果,为小麦纹枯病的研究提供抗病基因资源。其主要结论如下:（1）筛选得到了纹枯病诱导表达的β-1,3-葡聚糖酶基因DQ-GLU。在抗纹枯病小麦山农0431接种纹枯菌0 h DQ-GLU基因没有表达,6 h出现较高表达,在24 h略有降低:在感纹枯病小麦温麦6号同样接种纹枯菌后几乎没有表达。初步推测DQ-GLU基因参与了小麦对纹枯病菌的抗性反应。（2）构建了DQ-GLU基因原核表达载体,成功进行了诱导表达、体外复性及纯化、体外抑菌实验。将DQ-GLU基因插入到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21（DE3）成功地表达了GST-GLU融合蛋白。进一步分析表明GST-GLU融合蛋白几乎全部以包涵体的形式存在。分别对溶液的pH值、离子强度、还原剂和各种添加成分如精氨酸等的影响进行了观察,以便对复性条件进行优化。进而比较稀释复性法和透析复性法,最终建立起一套简便、实用的复性体系。体外抑菌实验表明,DQ-GLU基因表达产物对菌丝生长具有抑制作用,对水稻纹枯菌（Thanatephorus cucumeris Frank.Donk）、小麦纹枯菌、烟草赤星菌（Alternaria alternate）辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）均能产生比较明显的抑菌圈。（3）克隆几丁质酶基因RC7并构建了原核表达载体,成功进行了诱导表达、体外复性及纯化、体外抑菌实验。将RC7基因插入到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21（DE3）成功地表达了GST-RC7融合蛋白。进一步分析表明GST-RC7融合蛋白几乎全部以包涵体的形式存在。几丁质酶活测定表明RC7原核表达蛋白体外复性成功。体外抑菌实验表明,RC7基因表达产物对菌丝生长具有抑制作用,对水稻纹枯菌抑制作用最强,其次对小麦纹枯菌、小麦赤霉菌（Fusarium graminearum）、棉花黄萎菌（VerticilliuIll dahliae）、烟草赤星菌也有抑制作用。（4）分别构建DQ-GLU和RC7基因转化载体pUGLU、pURC7,基因枪法共转化扬麦12幼胚,获得转基因后代。基因枪轰击后,共获得326株再生植株,T0代PCR检测nos基因阳性植株为46株。转基因后代的分子检测过程中,结合了抗病鉴定,共筛选出抗小麦纹枯病（0级）且PCR检测阳性的转基因后代16株。（5）研究了抗菌肽Rs-AFP2基因在转基因后代中的基因组分布特点、抗纹枯病分析。Southern杂交结果表明,Rs-AFP2基因在小麦中为单拷贝,说明功能基因Rs-AFP2已经稳定整合到了小麦染色体上。小麦纹枯病抗性鉴定结果表明,分子检测阳性植株与对照及分子检测阴性植株（成株期感病指数为3～4级）相比均显示比较高的抗性（成株期感病指数为0级）,初步断定Rs-AFP2基因参与了小麦纹枯病抗性反应。