盐害是导致农作物减产的主要因素,培育耐盐转基因作物是一个快速有效的解决方法,但缺乏有效的目的基因是限制植物耐盐基因工程进一步发展的瓶颈。本论文的主要目的就在于寻找新的小麦耐盐相关基因,研究它们的功能,为深入了解植物耐盐分子机制及培育耐盐高产的转基因小麦提供有价值的参考。本论文先后通过蛋白质组学和基因芯片技术对盐胁迫下小麦耐盐突变体(RH8706-49)和敏盐突变体(H8706-34)进行了比较分析,寻找并克隆了2个小麦耐盐相关基因,并将其转化到拟南芥和水稻中进行耐盐性分析,主要实验结果如下:　　 1.小麦盐胁迫下的根微粒体蛋白质组比较　　 通过蛋白质双向电泳技术分离小麦耐盐突变体和敏盐突变体的根微粒体蛋白质组,共得到大约470个蛋白质点。比较这两个株系在盐胁迫前后的蛋白质表达变化,发现部分蛋白上调表达,部分蛋白下调表达,表明小麦耐盐突变体与敏盐突变体在耐盐性方面存在差异是植物体内大量蛋白表达协同变化的结果。　　 应用MALDI-TOF-MS技术对15、18、23和24号蛋白点进行质谱分析。这四个蛋白点在盐胁迫后表达显著增强,且在耐盐突变体中的表达量均明显高于在敏盐突变体中的表达量。15号蛋白点质谱鉴定为小麦亲环素,18号蛋白点质谱鉴定为V-H+-ATPase E亚基蛋白,23号和24号蛋白点质谱鉴定结果为阴性,这可能与小麦蛋白质数据库极不完善有关,也可能这两个蛋白是新的未知蛋白,这需经氨基酸测序加以确定。　　 2.小麦V-H+-ATPase E亚基基因的克隆和功能分析　　 根据质谱鉴定结果,利用电子克隆技术并结合RT-PCR方法成功克隆出小麦V-H+-ATPase E亚基全长cDNA序列。该基因全长为742bp,含有684bp的完整开放阅读框,编码227个氨基酸。经NCBI-Blast比对,该基因与大麦V-H+-ATPase E亚基基因同源性为96％,蛋白同源性高达98％,故命名为小麦V-H+-ATPase E亚基基因(Triticumasetivum vacular proton ATPase subunit E)。该基因已登陆Genebank,登陆号为DQ272489。　　 为了检测非生物胁迫下小麦V-H+-ATPase E亚基基因的表达模式,采用实时荧光定量PCR的方法,对该基因在盐、ABA、PEG和冷胁迫下的相对表达量进行分析,发现E亚基基因在小麦耐盐突变体中受盐和ABA诱导表达增强,受PEG和冷抑制表达降低,并且在叶与根中的表达存在组织特异性。比较E亚基在耐盐与敏盐突变体中的表达变化,发现盐及ABA胁迫后,E亚基基因在耐盐突变体中的表达均高于在敏盐突变体中的表达。以上结果从分子水平上验证了E亚基基因与小麦耐盐能力的正相关关系。　　 构建植物双元表达载体并转化拟南芥,对获得的纯合体转基因拟南芥进行耐盐性分析。结果显示,过表达E亚基基因的拟南芥在盐胁迫下,其萌发率和根长及。V-H+-ATPase活性均高于对照,细胞内Na+含量低于对照,整体植株存活状态好于对照,表明过表达小麦E亚基基因可增强转基因拟南芥的耐盐能力。　　 以上实验结果已投稿于(Plant Molecular Biology》(SCI影响因子3.65),经编辑审稿,已修回。　　 3.小麦盐胁迫响应基因TaSR的克隆和原核表达　　 通过基因芯片技术,对盐胁迫下小麦耐盐突变体RH8706-49中的总体基因表达进行研究,获得了61215个小麦基因的差异表达图谱(已发表于《中国农业科学》2007年第10期)。选取盐胁迫后表达升高的Cluster47-3号探针序列,通过电子克隆技术和RT-PCR方法成功克隆到该探针的全长cDNA序列。该基因全长937bp,含有870bp的完整开放阅读框,编码289个氨基酸。经NCBI-Blast比对,该基因是一个全新的未知蛋白基因,与水稻(Os03g0110900)和拟南芥(AT2G32500)的基因同源性分别为80％和66％,蛋白同源性分别为74％和49％,将其命名为TaSR(Triticum aestivum Salt Response gene)。该基因已登陆Genebank,登陆号为EF580107。　　 采用实时荧光定量PCR的方法检测小麦TaSR基因在盐胁迫下的表达,发现TaSR基因在小麦耐盐突变体中受盐诱导表达增强,而在敏盐突变体中表达有所下降。生物信息学预测TaSR具有Dabb保守结构域,这是一个胁迫响应结构域。结构预测TaSR蛋白具有蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、N-糖基化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点和一个钙调素结合位点,预示着该蛋白存在受蛋白激酶和Ca2+信号调控的可能。　　 构建TaSR基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行蛋白质的表达。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示,在转化菌中诱导出分子量约33kD的特异条带,分子量大小与TaSR蛋白一致。分析不同诱导时间的蛋白表达变化,发现在IPTG诱导3h时蛋白表达量最大。结果表明TaSR基因在原核细胞中成功表达为蛋白,这为今后纯化TaSR蛋白进行下一步研究奠定了基础。　　 4.小麦盐胁迫响应基因TaSR的亚细胞定位和功能分析　　 构建TaSR-GFP融合蛋白表达载体,通过激光共聚焦显微镜观察转基因拟南芥根部GFP荧光的分布,以此来确定TaSR基因的亚细胞定位。观察结果显示在转基因拟南芥中荧光主要位于细胞膜部位,而细胞核及其他部位没有绿色荧光。由此推测,小麦TaSR基因定位于细胞膜上,它很有可能编码一个膜蛋白。　　 构建植物双元表达载体并转化拟南芥,对获得的纯合体转基因拟南芥植株进行了耐盐性分析。结果显示,过表达小麦TaSR基因的拟南芥在盐胁迫下,其根长长于对照,整体植株存活状态也好于对照,这表明TaSR基因参与拟南芥对盐的胁迫响应,在其中起着正调控的作用。　　 通过PCR和RT-PCR的方法筛选并鉴定出拟南芥突变体,该突变体缺失AT2G32500.1(TaSR同源基因)的表达。对突变体进行耐盐性分析,发现突变体在盐胁迫下的萌发率和根长均低于对照,表明拟南芥突变体对盐敏感,这从反面进一步说明了TaSR基因与植物耐盐性相关。　　 通过原子吸收的方法测定转基因拟南芥和突变体在盐胁迫下的离子含量变化,得到一致结果,即TaSR基因在降低细胞Na+水平、维持高K+/Na+比和细胞K+、Ca2+水平的稳定方面起着重要作用。　　 为了确定TaSR基因在非生物胁迫信号通路中的作用,通过定量PCR对拟南芥各胁迫信号通路上已知的一些基因进行了分析。结果显示,在过表达小麦TaSR基因的拟南芥中,COR15a和FRY1基因表达增加,KIN2基因表达没有明显变化,而突变体中这些基因的表达均有明显降低；RD29B、P5CS、ADH、SAD1、SOS2和SOS3的表达变化不明显,这表明TaSR基因可能处在COR15a、FRY1和KIN2基因的上游,通过磷脂酶和CDPK途径参与渗透胁迫的调节。　　 5.小麦盐胁迫响应基因TaSR在水稻中的功能分析　　 小麦和水稻同属禾谷类作物,亲缘关系较近,为了更真实的反映TaSR基因的功能,我们以水稻作为转化体系研究了TaSR基因对盐胁迫的响应。构建水稻双元表达载体,将TaSR基因转入水稻进行过表达分析。结果显示,盐胁迫下转基因水稻在种子萌发、苗高、根长、植株存活率及叶片叶绿素含量方面均高于对照,表明过表达TaSR基因可提高水稻在植株早期生长及光合功能方面对盐胁迫的耐受能力。　　 采用RT-PCR的方法克隆了水稻OsSR基因(Os03g0110900,TaSR同源基因)的部分序列,构建RNAi载体并转入水稻中。经定量PCR鉴定,各转基因株系中OsSR基因发生了沉默,基因表达分别被抑制了70％-80％。对RNAi株系进行耐盐性分析,发现盐胁迫后,RNAi株系的植株存活率和叶片叶绿素含量均低于对照。以上结果表明OsSR基因沉默导致RNAi水稻对盐胁迫的敏感性增强,进一步说明TaSR基因在植株响应盐胁迫过程中发挥着重要作用。