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研究背景和目的神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是儿童期常见的颅外实体肿瘤之一,尤多见于5岁以下婴幼儿。NB最大的特点为临床表现、预后具有明显的异质性,一部分患者的病变可以出现自然消退或转为良性肿瘤,但另一部分病人诊断时已出现全身转移并常常快速进展以致最终致命,生存率很低。NB治疗方式主要为手术、化疗及放疗,但因其异质性大,目前临床仍缺乏可靠并有效的生物标志物提示预后。环状RNA（circular RNAs,circRNAs）是一类具有稳定闭合环状结构的内源性RNA分子,被发现在蛋白质合成、基因表达及转录后修饰等细胞生物学功能中发挥重要的调节作用。circHIPK3（hsacirc0000284）是起源于同源结构域相互作用蛋白激酶 3（Homeodomain-interacting protein kinase 3,HIPK3）基因第二个外显子的一种circRNA。很多证据表明circHIPK3可发挥microRNA（miRNA）“海绵”的作用,调控下游靶基因的表达,进而影响细胞的增殖与侵袭。而2019年最新的研究发现,circHIPK3也可能通过调节腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号等激活自噬通路,影响肿瘤细胞增殖。AMPK信号通路对肿瘤细胞增殖、凋亡具有重要调节作用。本研究的目的为观察circHIPK3对NB细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期及凋亡等恶性生物学行为的影响,并进一步探讨其分子机制。研究方法和材料1、利用一些常用的 circRNA 数据库,如 circBase、circRNADisease、MiOncoCirc、CircFunBase及CircInteractome等,结合生物信息学分析,进一步理解circHIPK3结构、分子特征,观察其在肿瘤中表达,并预测circHIPK3的生物学功能。2、细胞学实验材料:人神经母细胞瘤SK-N-AS细胞,人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,所有细胞维持在DME/F-12培养基中,加入10%的FBS,青霉素/链霉素（1:100）,在37℃含有5%CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞用于实验。3、建立circHIPK3-shRNA慢病毒稳转的SK-N-AS细胞及SH-SY5Y细胞株,利用细胞克隆形成实验及EdU荧光检测试剂盒观察敲低circHIPK3对两种NB细胞（SK-N-AS、SH-SY5Y）增殖的影响,用流式细胞仪检测细胞周期,利用Transwell细胞迁移实验、Matrigel Transwell实验及细胞划痕伤口愈合实验检测敲低circHIPK3对NB细胞侵袭能力、迁移能力的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V-PE）及TUNEL染色计数法检测细胞凋亡。另外,用Western blot检测总的和磷酸化的AMPKα、ACC、AKT、mTOR等蛋白表达,观察相应信号通路的改变,同时检测生长因子受体EGFR、PDGFRα的表达及细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。拟用正常SH-SY5Y细胞和circHIPK3-shRNA转染的SH-SY5Y细胞分别建立在体NB裸鼠模型,比较两组裸鼠的存活率、肿瘤大小,进一步在体验证circHIPK3对NB恶性生物学行为的影响。4、统计学处理:每个实验重复至少三次,每次获得具有相似的结果。在每个细胞实验中,至少使用三个孔/平皿。计量资料数据以均数±标准偏差（SD）表示。使用SPSS16.0软件进行分析统计,通过one-way ANOVA,Scheffe和Tukey检验计算p值。p<0.05被认为有统计学意义。研究结果1、数据库资料显示circHIPK3在多种不同肿瘤中存在表达异常,且在一些肿瘤中与患者的临床分期、总生存期具有相关性。进一步的生物信息学分析和预测显示HIPK3基因与AMPK及AKT-mTOR通路上多个基因都存在相互调控作用。2、转染慢病毒shRNA敲低circHIPK3后,通过细胞克隆形成实验及EdU荧光检测实验可观察到,SK-N-AS及SH-SY5Y细胞增殖显著受抑制;流式细胞仪检测后发现两种细胞的周期进程受阻于S期。Transwell细胞迁移实验及细胞划痕伤口愈合实验则显示,SK-N-AS及SH-SY5Y细胞的迁移和侵袭能力下降。3、敲低circHIPK3后,可诱导NB细胞的凋亡。通过流式细胞仪（Annexin V-PE）及TUNEL染色计数法进行细胞凋亡的检测,结果表明:转染circHIPK3-shRNA的SK-N-AS及SH-SY5Y细胞与对照组相比,细胞凋亡水平明显增加。4、在NB细胞中敲低circHIPK3后,可激活AMPK,并阻断AKT/mTOR信号活化。Western blot 结果显示,在 SK-N-AS 及 SH-SY5Y 细胞中,转染 circHIPK3-shRNA后可显著活化AMPK,并显著抑制AKT/mTOR信号通路的活化。同时,AMPK活化下调生长因子受体EGFR和PDGFRα的表达及细胞周期相关蛋白Cyclin D1的表达。这可能是敲低circHIPK3后引起NB细胞增殖减少,细胞周期阻滞及凋亡增加的主要机制。结论circHIPK3是NB发生发展过程中重要的调节因子。敲低circHIPK3后,能显著抑制NB细胞的增殖、侵袭和迁移能力,阻滞细胞周期,并明显诱导NB细胞凋亡。其分子生物学机制为敲低circHIPK3后,可明显活化AMPK,进一步导致生长因子受体EGFR/PDGFRα的下调及AKT/mTOR信号通路失活。circHIPK3有望成为NB治疗的新靶点。