目的：本研究旨在将中国美利奴细毛羊基因组BAC文库分两级构建高质量的三维结构混合池,同时设计一种高通量快速PCR筛选两级混合池的方法,为后续研究者从7.4万个克隆中快速筛选阳性克隆,以用于绵羊基因组物理图谱的绘制和基因的图位克隆等研究,为其提供作图“试剂”和克隆材料。 方法：用等级混合法构建中国美利奴细毛羊基因组BAC文库的三维一级混合池和二级混合池,一级混合池基于每4个384-well盘而构建,由相同的行、列分别构建行列的一级混合池,每盘各构建一个盘的一级混合池；将构建好的盘一级混合池(168个)以12列×1 4行的方式排列,每行(或列)各构建盘的二级混合池,将行(或列)标号相同的一级混合池分别混合成一个行(或列)的二级混合池。本研究中采用PCR方法筛选,采用一步筛选一个克隆或三步筛选多个克隆的策略。第一步筛选盘、行和列的二级混合池,此时可以直接确定一个阳性克隆,如果阳性克隆在两个以上,需采用三步筛选法,即阳性盘的确定和阳性盘中的阳性行、列的确定。 结果：共构建以一级盘混合池168个,一级行混合池672个,一级列混合池1008个；二级盘混合池26个(12+1.4),二级行混合池16个,二级列混合池24个。用绵羊基因组分子标记BF94-1为引物,用一步共66个PCR反应成功筛选到一个阳性克隆。 结论：本研究所构建的混合池至少可满足300次PCR筛选所需。用本研究中设计的一步或三步筛选策略可高效快速的筛选出大量阳性克隆,进而为绵羊基因组物理图谱的绘制和基因的图位克隆等研究供作图“试剂”和克隆材料。