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一、供体NK细胞对非清髓异基因造血干细胞移植中受体异基因反应的抑制作用及其机制目的:体外实验系统阐明异基因造血干细胞移植中,供体NK细胞对受体CD8+T细胞的否决作用机制;体内实验系统证明供体NK细胞抑制非清髓性异基因造血干细胞移植中受体的异基因反应从而促进植入。方法:在体外实验系统中,将C57BL/6(H-2b)小鼠的脾细胞作为反应细胞(模拟受体细胞),BALB/c(H-2d)小鼠的脾细胞经致死剂量照射后作为刺激细胞(模拟供体细胞),建立混合淋巴细胞培养体系(MLR)。3H嵌入法检测反应细胞的增殖情况;细胞毒性试验检测反应细胞对H-2d肿瘤细胞的杀伤作用。在此MLR系统中,加入致死剂量照射的BALB/c(H-2d)小鼠骨髓培养的体外激活的NK细胞(ALAK),模拟供体NK细胞,用同样方法检测C57BL/6(H-2b)反应细胞在H-2d抗原刺激下的繁殖和细胞杀伤功能。在MLR体系中加入TGF-β的阻断抗体,观察其是否有阻断供体NK细胞否决作用的效应;分别加入从Fas突变体小鼠和穿孔素敲基因鼠培养的NK细胞来阐明供体NK细胞否决作用是否通过Fas-FasL和穿孔素介导的细胞毒反应来完成。体内实验系统中,采用BALB/c(H-2d)小鼠做为供体鼠,同时用所获取的造血干细胞体外培养供体NK细胞;采用C57BL/6(H-2b)小鼠做为受体鼠,进行全身性照射的非清髓性移植前预处理。通过尾静脉注射对受体鼠进行异基因造血干细胞移植,共设以下三组:尾静脉注射供体造血干细胞组;尾静脉注射受体NK细胞和供体造血干细胞组;尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞组。造血系统再造完成后,取各组受体鼠脾细胞,流式细胞仪检测供体细胞的植入率,检测供体来源的B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量;3H嵌入法检测受体脾细胞在H-2d抗原刺激下的增殖情况;细胞毒性试验检测脾细胞对H-2d抗原包被的肿瘤细胞P815的杀伤作用;CTLL-2细胞增殖实验检测脾细胞在H-2d抗原刺激下所表达的IL-2水平。对以上实验结果进行统计学处理分析。结果:体外实验结果表明,激活的BABL/c小鼠H2d NK细胞可以显著抑制混合反应体系中C57BL/6小鼠来源的H2b反应细胞的增殖效应(p﹤0.01);激活的H2d NK细胞显著抑制H2b反应细胞对H2d抗原包被的肿瘤细胞的杀伤活性(p﹤0.01);相同数目的H2b NK细胞或者H2d脾细胞并未表现出相同的抑制作用;抗TGF-β阻断剂并不能减弱异基因NK细胞的抑制作用;Fas配体突变小鼠来源的NK细胞与野生型小鼠来源的NK细胞抑制作用无显著差别,穿孔素敲基因小鼠来源的NK细胞的抑制作用则有所减弱。体内实验结果显示,尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞实验组的供体细胞植入率明显高于其它两组(p﹤0.05);尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞实验组小鼠的脾脏细胞中供体来源的B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量明显高于其它两组(p﹤0.05);尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞实验组的3H嵌入、细胞毒性实验、及IL-2水平的受体异基因反应水平检测结果与另外两实验组相比显著降低(p﹤0.05)。结论:激活的异基因NK细胞能够特异性抑制异基因反应细胞的增殖效应和杀伤活性;颗粒酶介导的杀伤活性可能是这种抑制效应的机制之一,而Fas-Fas配体通路及TGFβ信号通路并非该抑制效应的作用机制;异基因NK细胞可以通过抑制受体细胞的异基因反应促进非清髓异基因造血干细胞的植入。二、供体NK细胞及IL-15对非清髓异基因造血干细胞移植的促进作用目的:探讨供体NK细胞与IL-15在非清髓异基因造血干细胞移植中对植入可能存在的协同促进效应。方法:采用C57BL/6(H-2b)小鼠做为供体鼠,同时用所获取的造血干细胞体外培养供体NK细胞;采用BABL/c(H-2d)小鼠做为受体鼠,进行全身性照射的非清髓性移植前预处理。通过尾静脉注射对受体鼠进行异基因造血干细胞移植,共设以下四组:尾静脉注射供体造血干细胞组;尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞组;尾静脉注射供体造血干细胞并在移植后腹腔注射IL-15组;尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞并在移植后腹腔注射IL-15组。构建重组小鼠IL-15基因的慢病毒表达载体,于293T细胞包装并获得病毒,感染供体来源的NK细胞,从而得到自身携带IL-15基因的供体NK细胞。同上建立小鼠非清髓异基因造血干细胞移植模型,实验分组如下:尾静脉注射供体造血干细胞组;尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞组;尾静脉注射供体造血干细胞并在移植后腹腔注射IL-15组;尾静脉注射携带IL-15基因的供体NK细胞及供体造血干细胞组。造血系统再造完成后,取以上各组的受体鼠脾细胞,流式细胞仪检测供体细胞的植入率,检测供体来源的B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量;3H嵌入法检测脾细胞在H-2b抗原刺激下的增殖情况;细胞毒性试验检测脾细胞对H-2b抗原包被的肿瘤细胞EL4的杀伤作用;CTLL-2细胞增殖实验检测脾细胞在H-2b抗原刺激下所表达的IL-2水平。对以上实验结果进行统计学处理分析。结果:在采用腹腔注射IL-15的实验体系中,尾静脉注射供体NK细胞和供体造血干细胞并在移植后腹腔注射IL-15组的植入率明显高于其它三组(p﹤0.05);其受体鼠脾细胞中供体来源的B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量明显高于其它三组(p﹤0.05);3H嵌入、细胞毒性实验、及IL-2水平的检测结果均与其它三组有显著性差异(p﹤0.05)。在供体NK细胞自身携带IL-15基因的实验体系中,初步实验结果证明:尾静脉注射携带IL-15基因的供体NK细胞及供体造血干细胞组的植入率明显高于其它三组(p﹤0.05);受体鼠脾细胞中供体来源的B细胞、NK细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量明显高于其它三组(p﹤0.05);3H嵌入、细胞毒性实验、及IL-2水平的检测结果均与其它三组有显著性差异(p﹤0.05)。结论:在小鼠的非清髓异基因造血干细胞移植模型中,供体NK细胞和IL-15的联合使用能够显著促进植入、增加供者来源的各细胞亚群的百分比,并能够抑制受者的异基因反应,但二者作用是否发生协同尚不明了。携带IL-15基因的供体NK细胞的输注也能同样显著促进植入、移植后免疫重建、抑制受者的异基因反应。三、小鼠IL-15亚型的发现及其功能的初步研究目的:探寻在小鼠脾脏细胞免疫激活状态下发现的小鼠IL-15亚型的基因结构、可能的产生机制及功能。方法:取C57BL/6小鼠脾脏,制备脾细胞悬液及骨髓细胞悬液,通过磁珠分选及CSF刺激原代培养小鼠B细胞及巨噬细胞。收集生长良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW246.7及原代培养的B细胞、巨噬细胞,Trizol-氯仿法提取各种细胞的总RNA,逆转录成cDNA作为模板,利用所设计的特异性引物,进行PCR扩增,得到小鼠IL-15基因的目的片段,2%琼脂糖电泳鉴定扩增产物。在LPS刺激培养12h的小鼠脾脏细胞中加入放线菌酮继续培养12h,并设LPS刺激培养24h的小鼠脾细胞及无任何处理的小鼠脾细胞作为对照,Western Blot检测各种培养条件下小鼠脾细胞中IL-15亚型蛋白的表达。克隆IL-15基因及其亚型,并构建IL-15及其亚型重组的pET43.1原核表达载体,于BL-21表达菌中自发表达,SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白并验证表达蛋白的可溶性,纯化获得有功能活性的IL-15及其亚型蛋白,Western Blot检测所得纯化蛋白。CTLL-2细胞增殖实验体外检测IL-15亚型的功能。结果:小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW246.7及原代培养的B细胞、巨噬细胞在LPS刺激培养后均可检测到缺失6号外显子的IL-15亚型。放线菌酮的加入可以减少LPS刺激所产生的该种亚型蛋白。重组IL-15及亚型的pET43.1表达载体构建成功,并成功纯化获得有功能的IL-15及IL-15亚型蛋白。该种IL-15亚型可能对正常IL-15蛋白的功能活性起负调控作用。结论:缺失6号外显子的IL-15亚型蛋白可能由LPS刺激细胞后IL-15mRNA进行选择性剪切而产生,B细胞及巨噬细胞在LPS刺激下均可产生此种亚型。此亚型蛋白可能在免疫系统激活状态下对正常IL-15蛋白的功能活性其负调控作用。