蜱是一类专性吸血且繁殖力极强的外寄生虫,宿主十分广泛,携带的多种病原体对人类及畜类危害严重。长角血蜱Haemaphysalis longicornis在我国及多个国家均有分布,根据生殖方式的不同分为两性生殖种群Haemaphysalis longicornis bisexual population(HLBP)和孤雌生殖种群Haemaphysalis longicornis parthenogenetic population(HLPP)。HLPP为三倍体,整个生活史中无雄蜱,雌蜱不需经过受精便可完成整个生命周期。胚胎发育是卵孵化成幼蜱期间重要的生理过程,卵黄蛋白(vitellin,Vn)降解是这个过程重要的生化事件之一,多种酶参与Vn降解,为胚胎发育提供了重要的营养。温度是影响酶活性的重要生态因子,研究温度对HLPP胚胎发育中酶及Vn降解的影响具有重要意义。本研究以HLPP为对象,运用生理生化和免疫学等现代生物学技术,研究不同温度下HLPP的孵化历期,胚胎发育不同阶段组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB)、组织蛋白酶D(Cathepsin D,CD)和酸性磷酸酶(Acid phosphatase,AP)的表达量及其动态变化,酶活性及其动态变化和Vn降解过程中亚基的动态变化。揭示不同温度下三种酶和Vn降解的规律,为深入阐明长角血蜱胚胎发育机制提供科学依据。1、观察并记录在16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下HLPP卵孵化为幼蜱的时间,结果显示26℃时平均需要24.6 d,16℃和20℃分别需要110.6 d和43.3 d;30℃和35℃条件下分别需要21.6 d和20.0 d。2、提取16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下HLPP胚胎发育过程中1 d、3 d、5d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d和17 d卵总RNA,对CB、CD和AP表达量进行分析。结果显示,不同温度下三种酶均有表达,温度对三种酶在不同发育时期mRNA表达有影响,高温使CB和AP最高表达量出现的天数提前,使CD最高表达量出现的天数延迟。CB在26℃条件下,其最高表达量出现在第15 d,16℃和20℃时的最高表达量也出现在第15 d,高温时30℃和35℃最高表达量天数均出现在第7 d。CD在26℃条件下最高表达量与20℃条件下最高表达量出现在同一天,为第3 d。随着温度的升高,30℃和35℃时该酶的最高表达量分别出现在第9 d和第15 d。26℃条件下AP在胚胎发育第9 d其表达量最高,16℃和20℃条件下该酶均在第11 d的表达量最高,30℃和35℃条件下AP都在胚胎发育第5 d表达量最高。3、提取16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下HLPP胚胎发育过程中1 d、3 d、5d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d和17 d卵总蛋白,分别对CB、CD和AP进行酶活分析。结果显示,不同温度下三种酶均有活性,CB在16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下分别在第17 d、9 d、3 d、17 d、15 d活性最高;CD在26℃条件下,胚胎发育第1 d其活性便达到最高值,16℃、20℃、30℃、35℃条件下分别在第13 d、17 d、13 d和15 d酶活性最高;AP在26℃条件下第9 d其活性最高,16℃、20℃、30℃、35℃条件下分别在第15 d、15 d、7 d和17 d酶活性达最高。4、提取16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下HLPP胚胎发育过程中1 d、3 d、5d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d和17 d卵总蛋白,进行SDS-PAGE,分析不同温度不同时期25 Kda~170 Kda之间卵内蛋白的变化。结果显示16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下,Vn在126 Kda处均有不同程度的降解;在26℃条件下,70 Kda和46 Kda处的Vn也明显随着胚胎发育逐渐降解,第13 d出现一条新的肽段;16℃时70 Kda处的Vn也发生降解,在第5 d出现一条新的肽段;其他温度未发现新产生的蛋白条带。选取16℃、20℃、26℃、30℃和35℃条件下,第1、5和9日龄的卵与Vn单克隆抗体进行Western-blot分析,发现不同温度下随着胚胎发育均有不同程度的降解,随着温度的升高降解程度越快,温度越低降解程度越慢。本研究揭示了HLPP在不同温度下CB、CD、AP的动态变化规律,明确了温度对Vn降解的影响,为深入阐明长角血蜱胚胎发育机制提供了科学依据。