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目的:利用同位素标记结合MRM绝对定量方法,对前期发现的CHD差异蛋白进行验证,并评价验证蛋白的筛检效能。建立一种非同位素标记结合MRM绝对定量方法。方法:运用统计学和生物信息学的技术,对课题组前期运用iTRAQ技术与MALDI-TOF-MS联用技术对VSD、ASD、TOF三组患者和正常对照组血清中的蛋白质组表达谱进行相对定量分析得到的329种差异蛋白进一步进行筛选。对选出的待验证蛋白借助UniProt数据库和辅助软件Skyline,优选其肽段和离子对,并建立和优化其MRM质谱扫描方法。对样品前处理方法进行选择:比较了乙腈沉淀、丙酮沉淀、Multi Affinity Removal Spin Cartridge MARS Hu-7HC亲和小柱富集对蛋白测定的影响;比较BCA蛋白定量方法和Bradford蛋白定量方法对总蛋白测定的影响;考查了尿素和RapiGestTM SF做变性剂的两种酶切方式对蛋白测定的影响。按最优的前处理方法对20例VSD患者和20例正常对照儿童血清进行处理,采用同位素标记结合MRM的绝对定量方法,测定两组样品中人细胞间粘附分子1(ICAM-1/CD54)、人血管内皮钙粘着蛋白复合体(VE-cad)、人胰岛素样生长因子2(IGF-2)、人血小板反应蛋白/凝血酶敏感蛋白1(TSP-1)、人载脂蛋白E(Apo-E)5种蛋白的含量。同时也采用ELISA的方法进行测定两组样品中的这五种蛋白。两种方法的定量结果采用筛检指标进行评价。为了降低蛋白质检测成本,建立一种非同位素标记肽段加入法与MRM技术相结合的绝对定量方法,并与稳定同位素标记法在方法的精密度、回收率、测定重复性以及定量线性范围方面进行了比较。结果:1.待验证蛋白的选取:对蛋白丰度进行log2变换后得到的该蛋白倍数比,以所有蛋白倍数比的标准差0.799为阈值,蛋白倍数比为0.799以上或-0.799以下为显著差异蛋白,得到①VSD组中上调的蛋白有14个,下调的蛋白有8个;②ASD组中上调的蛋白有10个,下调的蛋白有16个;③TOF组中上调的蛋白有13个蛋白是上调的,下调的蛋白有9个。对这些显著差异蛋白进行GO富集。综合蛋白丰度的倍数比和GO分析两个因素,选择蛋白丰度的倍数比高于大于0.799或小于-0.799,同时也在GO分析中参与生物过程、分子功能和细胞组成的有关的蛋白,最终从329个蛋白中选择了 14个蛋白作为待验证蛋白。2.通过UNIPROT数据库获取14个蛋白的全部序列,借助Skyline软件初步建立了 14个蛋白136个肽段544对离子对的质谱方法,在肽段优选阶段,经过实际混合血清样品的检测,14个蛋白中只有37个肽段278对离子对符合优选条件;在离子对优选阶段,剔除了峰型差、峰强度低、峰宽过大的离子对,最后优选得到9个蛋白14个肽段42个离子对适合进行质谱定量。在选定的肽段和离子对基础上,分别对每一个肽段的每对离子对的碰撞能量CE和去簇电压DP进行优化,得到的峰型和峰强度都比优化前得到很大的改善。3.样品的前处理方法的选择:在蛋白富集方法的选择上,我们比较了乙腈沉淀、丙酮沉淀、Multi Affinity Removal Spin Cartridge MARS Hu-7HC亲和小柱富集三种方法,MARS Hu-7HC亲和小柱富集效果约为丙酮沉淀的5倍,乙腈沉淀的10倍,因此我们选择了 MARS Hu-7HC亲和小柱富集。总蛋白浓度测定方法的选择上,考查了 BCA蛋白定量方法和Bradford蛋白定量方法对测定体系溶液的影响,实验结果表明,这两种方法测定总蛋白含量基本一致,所以我们选择BCA法。蛋白酶切方法的选择方面,分别考查了尿素和RapiGestTM SF做变性剂的两种酶切方式,实验结果显示,以尿素作为变性剂对同样来源的血清样品进行酶切,获得蛋白的酶切液肽段的含量相对较高,说明尿素作为变性剂的酶切方式酶切效果比较完全。4.采用MRM和ELISA两种方法对前期工作中挑选出五个差异蛋白VE-cad、TSP-1、AproE、ICAM-1/CD54 和 IGF-2 在 20 例 VSD 病例组和 20例正常对照组血清中的含量进行绝对定量,其中VE-cad、TSP-1、AproE三个蛋白含量有显著差异,证实了 ICAM-1/CD54和IGF-2两个蛋白为假阳性。MRM和ELISA两种方法测定VE-cad和AproE时,在ROC曲线、灵敏度.、特异度、TSP-1、假阴性率、假阳性率、正确指数、似然比、符合率、Kappa值、预测值等筛检指标都比较相似,但测定TSP-1时,ELISA方法优于MRM法。与超声心动图方法筛检CHD患者相比,两种方法测定VE-cad、TSP-1、AproE三个蛋白的灵敏度与超声心动图方法的灵敏度相似,但特异性低于超声心动图的特异性。5.新建立的非同位素标记肽段加入法与MRM技术相结合的蛋白质绝对定量方法与稳定同位素标记法相比,两种方法的精密度、回收率、测定重复性以及定量线性范围比较相似。两种方法在25例VSD患者血清中Apo E酶切液肽段含量测定结果的直线相关系数达到0.947,显示两者具有一致性,测定结果配对t检验的结果没有统计学意义,等效性检验的结果显示两种测定方法是等效的。说明建立的非同位素标记肽段加入法与MRM技术相结合的蛋白质绝对定量方法能够取代稳定同位素标记法,同时由于非同位素标记肽段加入法与M1RM技术相结合的蛋白质绝对定量方法不需要合成昂贵的同位素标记肽段,因此该方法具有经济、简便、准确度高、稳定性好的优点。结论:1.VE-cad、TSP-1、AproE蛋白是CHD患者血清中的生物标记物;2.使用MRM和ELISA测定VE-cad、TSP-1、Apo-E蛋白可以作为CHD的筛检试验。3.建立的非同位素标记肽段加入法能够取代稳定同位素标记法,作为经济简便的蛋白绝对定量新方法,具有较高的应用价值。