【摘 要】
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背景近年来,随着环境污染、日光浴的流行以及人口老龄化的增加,皮肤黑色素瘤的发病率和死亡率也逐年升高。由于黑色素瘤对放射治疗有较高的耐受抗性,放射治疗一般仅用于黑色素瘤手术后的清扫。目的阐明SIRT7在黑色素瘤放疗抗性形成中的功能与分子机制,为开发以SIRT7为目标、增强黑色素瘤放疗敏感性的靶向药物提供科学依据。方法（1）收集患者的痣和黑色素瘤组织,检测SIRT7的相对表达量。（2）在模拟治疗（Mo
【基金项目】
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广州市科技计划一般项目（201904010063）；
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背景近年来,随着环境污染、日光浴的流行以及人口老龄化的增加,皮肤黑色素瘤的发病率和死亡率也逐年升高。由于黑色素瘤对放射治疗有较高的耐受抗性,放射治疗一般仅用于黑色素瘤手术后的清扫。目的阐明SIRT7在黑色素瘤放疗抗性形成中的功能与分子机制,为开发以SIRT7为目标、增强黑色素瘤放疗敏感性的靶向药物提供科学依据。方法（1）收集患者的痣和黑色素瘤组织,检测SIRT7的相对表达量。（2）在模拟治疗（Mock）和放射治疗（IR）的条件下,采用RNA干扰技术敲减SIRT7,通过CCK-8实验、细胞克隆形成实验、流式细胞术及Transwell迁移实验检测SIRT7敲减对黑色素瘤A375细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。（3）通过彗星电泳实验、SYTOX染色实验检测黑色素瘤A375细胞的DNA损伤修复能力。（4）敲减SIRT7后进行转录组测序和GO/KEGG功能与通路富集分析以探究SIRT7调控的基因、蛋白以及信号通路,并用qPCR和Western blot检测确认。（5）通过免疫共沉淀实验分别对SIRT7和eIF2α进行免疫沉淀,检测SIRT7与eIF2α的相互作用,以及eIF2α的乙酰化和磷酸化水平。（6）通过染色质免疫沉淀ChIP-qPCR检测转录因子ATF4在DDIT3基因启动子位点的富集情况。（7）建立裸鼠异体移植瘤模型,并对移植瘤进行精准放疗,通过肿瘤生长曲线、qPCR、Western blot和免疫组化等方法来评估和验证SIRT7基因对黑色素瘤细胞放疗抗性的功能和作用机制。结果（1）SIRT7在黑色素瘤组织中呈高表达的状态;（2）在对照（Mock）组和放射治疗（IR）组,敲减SIRT7的黑色素瘤A375细胞的增殖和迁移能力都减弱,细胞凋亡都增加;（3）在IR处理条件下,敲减SIRT7,黑色素瘤A375细胞DNA损伤增加;（4）转录组测序后经GO/KEGG功能与信号通路富集分析发现,内质网应激和细胞凋亡信号通路显著性富集,通过qPCR和Western blot检测确认内质网应激和细胞凋亡相关基因和蛋白的表达水平显著上调;（5）敲减SIRT7可减弱SIRT7与eIF2α的相互作用,促进eIF2α乙酰化水平,同时增强了 eIF2α的磷酸化水平,是内质网应激下游细胞凋亡启动的重要原因;（6）染色质免疫沉淀ChIP-qPCR检测证实,敲除SIRT7显著增强了 ATF4在DDIT3基因启动子结合位点的富集结合;（7）在裸鼠移植瘤模型中的研究揭示,在Mock处理条件下,敲减SIRT7后肿瘤生长速度减慢;经过X线照射后,肿瘤的体积均有所下降,敲减SIRT7能够增强放疗对黑色素瘤的杀伤效果,qPCR、Western blot和免疫组化都验证了在敲减SIRT7的情况下内质网应激和细胞凋亡相关的基因和蛋白表达量均有增加。结论（1）SIRT7在黑色素瘤中发挥癌基因作用;（2）SIRT7可增强黑色素瘤DNA损伤修复的能力,提高放疗抗性;（3）SIRT7与eIF2α的相互作用可抑制eIF2α乙酰化水平以及磷酸化水平,减弱ATF4在DDIT3基因启动子结合位点的结合富集,从而缓解内质网应激,减少细胞凋亡;（4）体内实验进一步验证SIRT7在黑色素瘤中的发挥癌基因功能并增强放疗抗性的功能与机制。
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