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诱导分化疗法是治疗恶性肿瘤的新突破,即在体内外分化诱导剂存在下,肿瘤细胞趋向分化成熟,并向正常方向逆转,从而恢复正常细胞的表型及功能。维甲酸类化合物即是分化诱导剂的典范。本课题组前期以全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)为先导物,对其碳链末端极性基团进行结构改造并对环己烯环进行结构修饰,从合成出的一系列全新的维甲酸类衍生物中筛选出的4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)对急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4具有较强的诱导分化活性。本文将采用非肥胖糖尿/重症联合免疫缺陷(non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency,NOD/SCID)小鼠复制白血病模型旨在观察ATPR在体内对白血病的药理学作用,进一步评价其疗效,并讨论维甲酸受体和维甲类X受体在4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯诱导NB4细胞分化中的作用,进一步阐明其发挥药效的机制。目的:本研究旨在观察新型维甲酸衍生物ATPR对移植性人白血病模型小鼠的治疗作用及诱导NB4细胞分化中维甲酸受体和维甲类X受体的变化。方法:6-7周龄,体重18-22g的NOD/SCID小鼠于安徽省动物中心SPF级实验室适应一星期后,接受2.5Gy的全身X射线照射,在照射后24小时内,第三天取对数生长期NB4细胞(3×106个/只)用于移植。NOD/SCID小鼠随机分成6组:空白放射对照组、模型组、ATRA组(10mg/kg)、ATPR组(5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg)。对照组与模型组小鼠腹腔注射聚氧乙烯蓖麻油(溶剂),加药组于建模后第7d开始腹腔注射相应剂量的药物,每隔一天给药一次,连续四周。每日观察和记录动物死亡时间,并称量各组小鼠的体重;给药结束后,检测各组小鼠腹水瘤细胞指标:①巢式RT-PCR检测腹水瘤细胞中PML-RARα基因;②染色体核型分析腹水瘤细胞及NB4细胞株的染色体;③采用倒置显微镜进行腹水细胞分化的形态学观察;④采用NBT还原实验分析分化腹水细胞百分比。检测各组小鼠实体瘤细胞指标:①流式细胞分析仪检测腹部瘤的CD45,CD33,CD11b阳性率;②流式细胞分析仪检测各组小鼠实体瘤细胞周期;③取腹部实体瘤,HE染色观察其形态变化。体内瘤细胞浸润性考察:①统计小鼠体重的变化;②流式细胞分析仪检测肝、脾、肾、肺的CD45,CD33阳性率;③流式细胞分析仪检测各组小鼠肝,脾细胞周期;④取肝、脾、肾、肺、心、脑、骨髓,以10%甲醛固定48小时,石蜡包埋切片,HE染色后进行光镜观察;⑤统计生存天数,计算生命延长率。机制研究:①采用RT-PCR、Western Blot技术检测ATPR引起的NB4细胞中RARα,RARβ,RARγ,RXRα,RXRβ,RXRγmRNA及PML/RARα,RARβ及RARγ蛋白表达的变化;②采用免疫组织化学检测ATPR对白血病小鼠瘤组织中的RARβ,RARγ,RXRα的作用。结果:1在建立的的白血病动物模型中,NB4细胞能不同程度的浸润到肝,脾,肾,肺等组织器官中,模型建立成功。2 ATPR对APL-NOD/SCID模型小鼠腹水瘤细胞有诱导分化作用:ATPR可以诱导腹水瘤细胞向粒系分化成熟的改变;NBT阳性率增加。3 ATPR对APL-NOD/SCID模型小鼠腹部实体瘤细胞有诱导分化作用:瘤细胞表面分化抗原CD11b表达量显著升高;瘤细胞周期中G0/G1期细胞显著上升,呈G0/G1期阻滞;病理检查发现瘤细胞有向粒系分化成熟的改变。4 ATPR可以降低APL-NOD/SCID模型小鼠的体内浸润程度:肝、脾、肾、肺等主要组织的CD45,CD33阳性率不同程度的减少;肝与脾的增殖期(G2-M+S期)细胞减少;病理检查亦发现浸润程度有所减轻。5 ATPR作用NB4后,细胞中RARα,RARβ,RARγmRNA表达量升高,并呈时间依赖关系,RXRα,RXRβ,RXRγmRNA表达量无显著性变化;PML/RARα融合蛋白表达显著降低,RARβ及RARγ蛋白表达显著上升,并呈时间依赖;ATPR亦能升高白血病小鼠瘤组织RARβ和RARγ蛋白的表达,而对RXRα无影响。6 ATPR为5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg三个剂量时均可以延长APL-NOD/SCID模型小鼠的生存期。结论:1向接受亚致死量放射的NOD/SCID小鼠腹腔注射3×10~6个NB4细胞,可以成功建立APL模型。2新型维甲酸衍生物ATPR使腹水瘤和实体瘤细胞向粒系分化成熟,减少白血病细胞体内浸润性。3新型维甲酸衍生物ATPR可以显著延长APL模型小鼠的生存期。4 ATPR针对NB4细胞发挥药效的主要作用机制与ATRA类似,即一方面在胞内与RARs结合,形成RAR/RXR异源二聚体,与维甲酸应答元件(RARE)结合,从而调控基因转录及翻译,另一方面降解NB4细胞中PML/RARα融合蛋白,激活依赖RXRα的核激素分化途径,使NB4细胞趋向分化成熟。