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中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（Mesencephalic Astrocyte Derived Neurotrophic Factor,MANF）,是一种内质网应激蛋白,也是一种新型保守性神经营养因子,属于神经营养因子家族。MANF不仅对神经元和非神经细胞具有保护作用,还有促进细胞存活、参与炎症、调节免疫、抑制肿瘤细胞增殖等功能。研究表明,MANF在动物脑、肝脏、心脏、脾脏、肾脏、眼睛、血液、唾液、骨骼、软骨、睾丸、脾脏、胰腺等几乎所有组织器官中表达。近几年关于MANF在人脑相关疾病的研究取得重要进展。但是目前MANF在人脑的表达分布系统性研究还没有报道。在本研究中我们采用免疫组化染色技术检测MANF在人及大、小鼠脑中的表达分布。目的:通过免疫组织化学染色技术检测MANF在人及大、小鼠脑中的表达分布,并比较在人及大、小鼠脑中的表达分布差异。方法:获取人、小鼠和大鼠脑样本。从人脑组织资源库获得死亡后人脑组织样本,年龄分布在39-82岁,结合捐献者生前临床检验诊断报告,排除脑血管异常、脑萎缩、中脑黑质病变等脑部病变。在病人死后约6小时内进行解剖,打开颅骨,取出全脑,福尔马林固定后进行脱水、石蜡包埋、切片;对SD大鼠、C57小鼠腹腔麻醉后进行心脏灌流,之后取出全脑,进行脱水、石蜡包埋和切片。采用免疫组织化学染色技术检测MANF蛋白的表达分布。结果:1.人脑中MANF蛋白的表达分布总的来说,MANF在此研究关注的脑区都有表达。但是MANF表达水平在不同的脑区显示出差异性。大脑皮层内的不同区以及皮层下区域MANF表达水平无显著差异;皮层下各区域MANF的表达水平无显著统计学差异;脑干和小脑区域如红核、延髓、小脑皮层及齿状核显示出阳性染色,MANF在红核中显示出部分神经纤维染色和细胞染色,而延髓中显示绝大部分的神经纤维染色和极少的细胞染色。MANF在黑质显示出极强阳性染色,其染色强度显著高于脑干和小脑其他区域。整体上,皮层中MANF的表达水平显著高于皮层下,脑干和小脑。2.小鼠脑中MANF蛋白的表达分布MANF在C57小鼠大脑皮层表达水平显著高于除下丘脑以外的其他脑区;在皮层下区域,如在纹状体中,MANF阳性染色多分布于神经纤维,而细胞中极少见,其表达水平显著低于其他组;在下丘脑中,MANF的表达水平显著高于海马,背侧丘脑和纹状体;在小脑皮层MANF表达水平显著低于皮层、海马和下丘脑。3.大鼠脑中MANF蛋白的表达分布MANF蛋白在大鼠脑组织中表达分布研究结果与研究报道大致相同。在大脑皮层中,蛋白表达水平显著高于其他脑区;在皮层下区域,如在纹状体中,与小鼠类似,MANF染色多分布于神经纤维,而细胞中极少见,其表达水平显著低于其他组;在小脑皮层中,其表达水平显著低于皮层,海马和下丘脑。结论:本研究通过免疫组织化学染色系统检测了MANF在人和大、小鼠脑中的表达特点,发现在同一物种中MANF蛋白在不同脑区表达水平具有差异性;而在人、大鼠和小鼠不同物种间MANF在脑中表达分布特点较为一致。组织透明技术（Tissue clearing technique）是指应用水溶性有机溶剂或者亲水性试剂,对固定组织通过浸泡、电泳或灌注等方式进行透明化处理,然后应用高折射率介质匹配组织折射率,降低光散射,使组织达到光学透明,进而增加成像深度和图像对比度的技术。其原理是生物组织由于位于细胞膜结构的脂质物质的存在,使组织具有较强的光散射及折射能力,导致光线无法穿透组织,呈现非透明状态。通过除去脂质结构或改变组织的折射率,降低光散射,从而使组织呈现透明状态。它可以在不破坏器官完整性的前提下,观察其内在显微结构,避免了切片间的信息丢失,真正实现了细胞等结构的三维成像。目前组织透明技术与方法被广泛应用于脊椎动物研究。在本研究中,我们采用TMPDE（Trimethylolpropane triglycidy I ether）透明技术,将100μm厚度的人脑皮层和小鼠皮层透明化,然后进行免疫荧光染色,并进行二维及三维成像,原位呈现MANF在人脑皮层和小鼠皮层中的立体微观解剖结构。目的:利用TMPDE组织透明技术,实现MANF在人脑皮层和小鼠皮层的二维及三维成像,观察MANF在人脑皮层和小鼠皮层的立体微观解剖结构。方法:获取人以及小鼠脑组织样本。在病人死后6小时内进行解剖,打开颅骨,取出全脑,排除脑血管异常、脑萎缩、中脑黑质病变等脑部病变,取出前额叶皮层。对C57小鼠进行腹腔麻醉,随后进行心脏灌流,取出全脑组织。随后采用TMPDE透明技术使组织透明化,使用MANF抗体进行免疫荧光染色,并进行二维和三维成像,检测MANF的表达分布,并观察其立体微观解剖结构。结果:1.TMPDE方法对被检测抗体的兼容性较强。2.100μm厚度的人脑皮层和小鼠皮层可以通过TMPDE透明技术实现透明化3.透明后的人脑皮层和小鼠皮层,通过免疫荧光染色,结果表明,MANF阳性细胞被标记,其三维成像厚度比未透明组织成像厚度增加,但特异荧光信号较弱。结论:使用TMPDE的透明方法,可以实现100μm的人脑皮层和小鼠皮层透明化;MANF在透明后的100μm的人脑皮层和小鼠皮层,相对于未透明组织,MANF被标记的阳性率更高,但特异性荧光信号较弱。