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背景：
肺癌是一种恶性肺肿瘤，以肺组织中无限的细胞增殖为主要特征。多环芳香碳氢化合物（PAH）及其衍生物已被证实与吸烟和空气污染所引起的肺癌的发生发展密切相关。慢性炎症与肿瘤的发生发展密切相关，主要包括促进肿瘤恶性转变、肿瘤细胞的增殖与侵袭、肿瘤组织血管的生成。炎症细胞通过释放多种细胞因子、趋化因子来调节肺慢性炎症微环境，促进支气管上皮细胞转化、逐步发展到癌前病变及癌转移，在肺癌的发生、发展中起着重要作用。在该过程中，免疫微环境可诱导一种特异性的免疫抑制细胞群体-髓源抑制性细胞的产生。髓源抑制性细胞（MDSCs）是一种异质性的细胞群体，由未成熟的巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞和其它早期分化的髓系细胞组成。它是一种重要的机体免疫调节细胞，主要包括单核系monocyticMDSCs(M-MDSCs)和粒系granulocyticMDSCs(G-MDSCs)两个亚群。MDSCs通过抑制机体固有免疫系统和适应性免疫系统进而抑制宿主的抗肿瘤免疫反应。已有研究表明MDSCs在癌症、慢性感染和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用。但MDSC及其亚群在B[a]P诱导的肺慢性炎症至肺癌发生发展中的作用及其功能变化尚未见系统报道。
本课题组前期实验，已通过研究MDSC及其亚群在经B[a]P诱导的小鼠肺慢性炎症微环境的发生、持续及肺癌发生过程中的含量变化；以及该过程中其分泌的一些功能因子IL-10、TNF-α及其表达的PD-L1水平的变化，初步分析了MDSC在肺慢性炎症至肺癌发展过程中的关键作用，然而对该过程其表达及分泌的关键抑制性、增殖活性相关的细胞因子(TGF-β、IL-6、GM-CSF）；它在体外对T细胞、NK细胞增殖效应及对其功能的影响还未做深入探究。因此，本课题采用流式细胞术（FCM）对MDSC的关键效应功能分子进行检测，并无菌分选获得各时期小鼠免疫微环境（肺）中的MDSC进行体外效应的探究，进而深入探究B[a]P诱导的肺慢性炎症至肺癌发展过程中MDSC的免疫作用及其功能变化。有助临床上针对MDSC及其相关促炎因子为靶点，通过改善肺慢性炎症组织内免疫抑制微环境为肺癌早期的诊断和免疫治疗提供新的策略。
目的:
1.构建肺慢性炎症至肺癌发生过程的雄性昆明（KM）小鼠动物模型。
2.明确MDSC及其亚群在苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症微环境至肺癌发生发展过程中表达的功能性膜结合型TGF-β及其分泌的增殖活化相关细胞因子GM-CSF、IL-6水平的变化，分析其增殖活化效应。
3.探究苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中MDSC对CD8+T细胞、NK细胞增殖效应及功能的影响。
方法：
KM雄性6-8周龄小鼠胸壁穿刺肺内直接注射苯并芘或玉米油构建小鼠动物模型。苯并芘以玉米油溶解（浓度：20mg/ml），经小鼠右侧胸腔肋间隙注射。每周注射一次，50ul/只/次，连续注射四次，分别于注射四次后的一个月、三个月、六个月时间点处死小鼠。取小鼠新鲜肺组织固定、包埋，经HE染色，观察小鼠肺组织病理学改变；流式细胞术检测小鼠肺组织和脾脏及外周血中MDSC及其亚群M-MDSC表达的TGF-β及其分泌的增殖活化相关细胞因子GM-CSF、IL-6水平的变化；流式细胞术分选出小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中肺组织中的MDSC、正常小鼠脾脏中的CD8+T细胞、NK细胞，分别将MDSC与CD8+T细胞、NK细胞进行体外细胞共培养，探究苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中MDSC对CD8+T细胞、NK细胞增殖抑制效应及对其分泌IFN-r功能的影响；免疫组织化学方法检测临床肺组织标本中CD33的表达水平。
结果：
1.本课题成功利用B[a]P构建了雄性KM小鼠肺慢性炎症至肺癌发生模型。6-8周龄的雄性KM小鼠每周经胸壁穿刺肺内直接注射B[a]P（溶剂为玉米油）一次，连续注射四周的方法构建小鼠肺癌模型。HE染色结果显示：B[a]P暴露一个月后小鼠出现肺慢性炎症，溶剂对照组（玉米油组）小鼠未发现炎症细胞浸润；三个月后B[a]P组小鼠肺部炎症细胞增殖明显，溶剂对照组（玉米油组）小鼠肺部炎症细胞浸润不明显；暴露六个月后B[a]P实验组35%（7/20）的小鼠发生肺癌，而溶剂对照组（0/20）未见肿瘤。
2.流式结果显示：B[a]P暴露后，在暴露早期（一个月）小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β量不明显，随暴露时间的延长，在暴露中晚期（三个月、六个月后）小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间相比较均具有统计学差异；而玉米油对照组在暴露早期没有明显变化，于暴露后期，MDSC表达的TGF-β水平表达有所升高，但没有B[a]P组显著。表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
3.流式结果显示：B[a]P暴露早期（一个月）时，小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β量相比于玉米油对照组无明显差异（P＞0.05），在暴露中晚期（三个月、六个月后）小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β量显著增多，且与各B[a]P组暴露时间点组间及对应时期玉米油对照组相比较，均具有统计学差异；而玉米油对照组在暴露早期没有明显变化，于暴露后期，M-MDSC表达的TGF-β水平表达有所升高，但没有B[a]P组显著。表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
4.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠外周血中MDSC表达的TGF-β量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠外周血中MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
5.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC分泌的GM-CSF量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC分泌的GM-CSF水平逐渐上调。
6.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠脾中MDSC分泌的GM-CSF量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠脾中MDSC分泌的GM-CSF水平逐渐上调。
7.流式结果显示：B[a]P暴露早期（一个月）时，小鼠肺组织中MDSC分泌的IL-6的量相比于玉米油对照组无明显差异（P＞0.05），在暴露中期（三个月）小鼠肺组织中MDSC分泌的IL-6的量相比对应时期玉米油对照组增多，具有统计学差异；在暴露中期以后，随着暴露时间的延长，小鼠肺中MDSC分泌的IL-6水平逐渐上调，差异具有统计学意义。
8.体外共培养实验结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠免疫微环境肺部MDSC对CD8+T细胞的增殖及分泌IFN-γ能力的抑制逐渐增强，暴露后期B[a]P组间差异具有统计学意义。随暴露时间的延长，MDSC对NK细胞的增殖抑制能力于各组间无统计学差异。但其对NK细胞分泌IFN-γ能力的抑制，在B[a]P暴露的早、中期，随暴露时间的延长，B[a]P暴露组与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；在B[a]P暴露的中、晚期，随暴露时间的延长，B[a]P暴露组组间相比较具有统计学差异。
9.免疫组织化学结果显示：CD33定位于细胞膜，于胞膜部位呈现不同程度的棕黄色。细胞浆也有少量表达，大部分表达于癌巢间正常细胞，可见MDSC的细胞核较大，为肾形和马蹄形，胞浆丰富，细胞形态不规则，呈现出髓系前体细胞的形态。正常肺组织和癌旁组织基本无阳性染色，而肺癌组织中CD33阳性染色程度升高，差异具有统计学意义。该临床肺组织标本研究表明：相比正常与癌旁组织（基本阴性表达），肺癌组织中出现了不同程度的MDSC表达，表明其在肺癌的发展中起着一定的作用。
结论：
本课题利用胸壁穿刺肺内直接注射苯并芘成功构建了KM小鼠肺慢性炎症至肺癌的动物模型；在苯并芘诱导的肺慢性炎症至肺癌的发生过程中小鼠肺组织以及脾、外周血中MDSC、M-MDSC分泌的细胞因子GM-CSF、IL-6的量增多，膜结合型TGF-β的表达水平升高；通过体外细胞共培养研究表明，该发生过程时期MDSC对CD8+T细胞增殖抑制效应增强，且使CD8+T细胞、NK细胞分泌IFN-r功能减弱；临床肺组织标本中CD33表达水平显示，肿瘤组织MDSC相对癌旁、正常组织高表达。揭示了MDSC、M-MDSC在一定程度上参与了香烟诱发的肺慢性炎症的维持，发挥了免疫抑制作用，促进了肺慢性炎症至肺癌的发生发展，并对其在该过程中的功能变化进行了初步探究。
肺癌是一种恶性肺肿瘤，以肺组织中无限的细胞增殖为主要特征。多环芳香碳氢化合物（PAH）及其衍生物已被证实与吸烟和空气污染所引起的肺癌的发生发展密切相关。慢性炎症与肿瘤的发生发展密切相关，主要包括促进肿瘤恶性转变、肿瘤细胞的增殖与侵袭、肿瘤组织血管的生成。炎症细胞通过释放多种细胞因子、趋化因子来调节肺慢性炎症微环境，促进支气管上皮细胞转化、逐步发展到癌前病变及癌转移，在肺癌的发生、发展中起着重要作用。在该过程中，免疫微环境可诱导一种特异性的免疫抑制细胞群体-髓源抑制性细胞的产生。髓源抑制性细胞（MDSCs）是一种异质性的细胞群体，由未成熟的巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞和其它早期分化的髓系细胞组成。它是一种重要的机体免疫调节细胞，主要包括单核系monocyticMDSCs(M-MDSCs)和粒系granulocyticMDSCs(G-MDSCs)两个亚群。MDSCs通过抑制机体固有免疫系统和适应性免疫系统进而抑制宿主的抗肿瘤免疫反应。已有研究表明MDSCs在癌症、慢性感染和自身免疫性疾病的发生发展中发挥了重要作用。但MDSC及其亚群在B[a]P诱导的肺慢性炎症至肺癌发生发展中的作用及其功能变化尚未见系统报道。
本课题组前期实验，已通过研究MDSC及其亚群在经B[a]P诱导的小鼠肺慢性炎症微环境的发生、持续及肺癌发生过程中的含量变化；以及该过程中其分泌的一些功能因子IL-10、TNF-α及其表达的PD-L1水平的变化，初步分析了MDSC在肺慢性炎症至肺癌发展过程中的关键作用，然而对该过程其表达及分泌的关键抑制性、增殖活性相关的细胞因子(TGF-β、IL-6、GM-CSF）；它在体外对T细胞、NK细胞增殖效应及对其功能的影响还未做深入探究。因此，本课题采用流式细胞术（FCM）对MDSC的关键效应功能分子进行检测，并无菌分选获得各时期小鼠免疫微环境（肺）中的MDSC进行体外效应的探究，进而深入探究B[a]P诱导的肺慢性炎症至肺癌发展过程中MDSC的免疫作用及其功能变化。有助临床上针对MDSC及其相关促炎因子为靶点，通过改善肺慢性炎症组织内免疫抑制微环境为肺癌早期的诊断和免疫治疗提供新的策略。
目的:
1.构建肺慢性炎症至肺癌发生过程的雄性昆明（KM）小鼠动物模型。
2.明确MDSC及其亚群在苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症微环境至肺癌发生发展过程中表达的功能性膜结合型TGF-β及其分泌的增殖活化相关细胞因子GM-CSF、IL-6水平的变化，分析其增殖活化效应。
3.探究苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中MDSC对CD8+T细胞、NK细胞增殖效应及功能的影响。
方法：
KM雄性6-8周龄小鼠胸壁穿刺肺内直接注射苯并芘或玉米油构建小鼠动物模型。苯并芘以玉米油溶解（浓度：20mg/ml），经小鼠右侧胸腔肋间隙注射。每周注射一次，50ul/只/次，连续注射四次，分别于注射四次后的一个月、三个月、六个月时间点处死小鼠。取小鼠新鲜肺组织固定、包埋，经HE染色，观察小鼠肺组织病理学改变；流式细胞术检测小鼠肺组织和脾脏及外周血中MDSC及其亚群M-MDSC表达的TGF-β及其分泌的增殖活化相关细胞因子GM-CSF、IL-6水平的变化；流式细胞术分选出小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中肺组织中的MDSC、正常小鼠脾脏中的CD8+T细胞、NK细胞，分别将MDSC与CD8+T细胞、NK细胞进行体外细胞共培养，探究苯并芘诱导的小鼠肺慢性炎症至肺癌发生过程中MDSC对CD8+T细胞、NK细胞增殖抑制效应及对其分泌IFN-r功能的影响；免疫组织化学方法检测临床肺组织标本中CD33的表达水平。
结果：
1.本课题成功利用B[a]P构建了雄性KM小鼠肺慢性炎症至肺癌发生模型。6-8周龄的雄性KM小鼠每周经胸壁穿刺肺内直接注射B[a]P（溶剂为玉米油）一次，连续注射四周的方法构建小鼠肺癌模型。HE染色结果显示：B[a]P暴露一个月后小鼠出现肺慢性炎症，溶剂对照组（玉米油组）小鼠未发现炎症细胞浸润；三个月后B[a]P组小鼠肺部炎症细胞增殖明显，溶剂对照组（玉米油组）小鼠肺部炎症细胞浸润不明显；暴露六个月后B[a]P实验组35%（7/20）的小鼠发生肺癌，而溶剂对照组（0/20）未见肿瘤。
2.流式结果显示：B[a]P暴露后，在暴露早期（一个月）小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β量不明显，随暴露时间的延长，在暴露中晚期（三个月、六个月后）小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间相比较均具有统计学差异；而玉米油对照组在暴露早期没有明显变化，于暴露后期，MDSC表达的TGF-β水平表达有所升高，但没有B[a]P组显著。表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
3.流式结果显示：B[a]P暴露早期（一个月）时，小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β量相比于玉米油对照组无明显差异（P＞0.05），在暴露中晚期（三个月、六个月后）小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β量显著增多，且与各B[a]P组暴露时间点组间及对应时期玉米油对照组相比较，均具有统计学差异；而玉米油对照组在暴露早期没有明显变化，于暴露后期，M-MDSC表达的TGF-β水平表达有所升高，但没有B[a]P组显著。表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中M-MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
4.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠外周血中MDSC表达的TGF-β量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠外周血中MDSC表达的TGF-β水平逐渐上调。
5.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC分泌的GM-CSF量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠肺组织中MDSC分泌的GM-CSF水平逐渐上调。
6.流式结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠脾中MDSC分泌的GM-CSF量显著增多，各B[a]P组暴露时间点组间及与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；表明随着暴露时间的延长，小鼠脾中MDSC分泌的GM-CSF水平逐渐上调。
7.流式结果显示：B[a]P暴露早期（一个月）时，小鼠肺组织中MDSC分泌的IL-6的量相比于玉米油对照组无明显差异（P＞0.05），在暴露中期（三个月）小鼠肺组织中MDSC分泌的IL-6的量相比对应时期玉米油对照组增多，具有统计学差异；在暴露中期以后，随着暴露时间的延长，小鼠肺中MDSC分泌的IL-6水平逐渐上调，差异具有统计学意义。
8.体外共培养实验结果显示：B[a]P暴露后，随暴露时间的延长，小鼠免疫微环境肺部MDSC对CD8+T细胞的增殖及分泌IFN-γ能力的抑制逐渐增强，暴露后期B[a]P组间差异具有统计学意义。随暴露时间的延长，MDSC对NK细胞的增殖抑制能力于各组间无统计学差异。但其对NK细胞分泌IFN-γ能力的抑制，在B[a]P暴露的早、中期，随暴露时间的延长，B[a]P暴露组与对应时期玉米油对照组相比较均具有统计学差异；在B[a]P暴露的中、晚期，随暴露时间的延长，B[a]P暴露组组间相比较具有统计学差异。
9.免疫组织化学结果显示：CD33定位于细胞膜，于胞膜部位呈现不同程度的棕黄色。细胞浆也有少量表达，大部分表达于癌巢间正常细胞，可见MDSC的细胞核较大，为肾形和马蹄形，胞浆丰富，细胞形态不规则，呈现出髓系前体细胞的形态。正常肺组织和癌旁组织基本无阳性染色，而肺癌组织中CD33阳性染色程度升高，差异具有统计学意义。该临床肺组织标本研究表明：相比正常与癌旁组织（基本阴性表达），肺癌组织中出现了不同程度的MDSC表达，表明其在肺癌的发展中起着一定的作用。
结论：
本课题利用胸壁穿刺肺内直接注射苯并芘成功构建了KM小鼠肺慢性炎症至肺癌的动物模型；在苯并芘诱导的肺慢性炎症至肺癌的发生过程中小鼠肺组织以及脾、外周血中MDSC、M-MDSC分泌的细胞因子GM-CSF、IL-6的量增多，膜结合型TGF-β的表达水平升高；通过体外细胞共培养研究表明，该发生过程时期MDSC对CD8+T细胞增殖抑制效应增强，且使CD8+T细胞、NK细胞分泌IFN-r功能减弱；临床肺组织标本中CD33表达水平显示，肿瘤组织MDSC相对癌旁、正常组织高表达。揭示了MDSC、M-MDSC在一定程度上参与了香烟诱发的肺慢性炎症的维持，发挥了免疫抑制作用，促进了肺慢性炎症至肺癌的发生发展，并对其在该过程中的功能变化进行了初步探究。