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目的:癌症是全球第二大常见死因,癌症形成的分子机制十分复杂,血管生成是癌症的一个标志。核转录因子NF-E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-derived2-like 2,又称Nrf2)是一种在内源性和外源性应激源诱导下普遍存在的转录因子,在抵御氧化应激,维持机体氧化还原稳态中发挥重要作用。尽管在肿瘤发展的过程中,Nrf2在多种细胞中发挥作用,但人们对血管内皮细胞Nrf2发挥的作用关注甚少。本研究利用血管内皮细胞特异性Nrf2敲除小鼠建立皮下荷瘤模型,研究血管内皮细胞Nrf2在肿瘤血管新生和肿瘤生长中的作用,并通过构建Nrf2沉默的小鼠血管内皮细胞系,探索可能的机制。研究方法:1.血管内皮细胞Nrf2基因敲除小鼠模型的构建:采用C57BL/6遗传背景的小鼠构建Cdh5-Cre,Nrf2(E)-KI和Nrf2(E)-KO三种转基因小鼠,并进行基因型鉴定。2.小鼠肿瘤生长模型的构建:将处于指数增长期并且状态良好的小鼠肺癌细胞(3LL,8×10~5个/只)皮下注射到6~8周龄的Cdh5-Cre,Nrf2(E)-KI或Nrf2(E)-KO小鼠的右前肢腋下部位,监测小鼠体重和肿瘤生长情况,于14天之后收取小鼠皮下肿瘤瘤体。3.小鼠皮下荷瘤模型的评价与鉴定:肿瘤生长模型建立后,每两天测量一次小鼠体重和皮下肿瘤长径与短径;收鼠后测量肿瘤重量;对肿瘤组织冰冻切片进行CD31免疫荧光染色,评估肿瘤内血管密度;对肿瘤组织石蜡切片进行Ki-67免疫组化染色分析,评估肿瘤增殖水平;检测肿瘤组织中cleaved Caspase-3蛋白含量,评估肿瘤凋亡水平;检测肿瘤组织中VEGFR2及其磷酸化蛋白水平,评估血管新生相关蛋白表达水平。4.血管内皮细胞Nrf2基因沉默与鉴定:用携带靶向Nrf2 sh RNA的慢病毒(Nrf2-KD)与非靶标阴性对照慢病毒(Scramble,Scr)转染小鼠血管内皮细胞(SVEC4-10)后,加入0.5μg/m L嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞,并检测m RNA及蛋白表达水平来鉴定Nrf2沉默效果。5.细胞共培养:血管内皮细胞Scramble或Nrf2-KD接种于6孔板中(7.5×10~5个/孔),共培养插件(0.4μm微孔)上层加入3LL细胞(1×10~6个/孔),用含10%FBS的DMEM共培养两种细胞,48小时后收集SVEC4-10进行实验。6.细胞迁移实验:从共培养体系中获取血管内皮细胞Scramble和Nrf2-KD,将其接种至Transwell小室(8μm微孔)上层,小室内采用无血清培养液,小室下层采用含10%FBS的培养液,24小时后通过结晶紫染色观察穿过小室的细胞数目。7.肿瘤细胞条件培养液处理血管内皮细胞:收取3LL细胞培养24小时后的培养液上清,处理血管内皮细胞5、10、20 min,检测VEGFR2、ERK蛋白及其磷酸化蛋白表达水平。结果:1.血管内皮细胞Nrf2基因敲除小鼠模型验证:为了确认血管内皮细胞Nrf2敲除小鼠模型是否建立成功,我们通过基因型鉴定,确认了Cdh5-Cre、Nrf2(E)-KI和Nrf2(E)-KO三组小鼠的基因型。2.血管内皮细胞Nrf2缺失促进荷瘤小鼠体内肿瘤生长:为了评估肿瘤生长速度,我们将3LL细胞接种到三组小鼠的右前肢腋下部位,持续观察肿瘤生长14天并收取肿瘤。与对照组相比,Nrf2(E)-KO小鼠体内的肿瘤生长速度加快(P<0.05)、肿瘤重量增加(P<0.05)。3.血管内皮细胞Nrf2缺失增加荷瘤小鼠瘤体内血管生成:为了评估肿瘤血管生成,我们对肿瘤组织进行冰冻切片,并进行血管内皮细胞特异性标记物CD31免疫荧光染色。CD31阳性区域的定量显示,与Nrf2(E)-KI组肿瘤相比,Nrf2(E)-KO组肿瘤的血管密度增加(P<0.01)。4.血管内皮细胞Nrf2缺失增加荷瘤小鼠肿瘤内VEGFR2及其磷酸化水平:为了评估肿瘤血管新生相关蛋白的水平,我们提取了肿瘤组织蛋白,检测了VEGFR2蛋白及其磷酸化水平,发现Nrf2(E)-KO小鼠肿瘤组织中VEGFR2蛋白及其磷酸化水平均升高(P<0.05)。5.血管内皮细胞Nrf2缺失促进荷瘤小鼠体内肿瘤细胞增殖:为了评估肿瘤血管密度增加是否促进肿瘤细胞增殖,我们对肿瘤组织石蜡切片进行了Ki-67免疫组化分析,结果显示Nrf2(E)-KO小鼠肿瘤中Ki-67阳性染色比Nrf2(E)-KI小鼠更多(P<0.001)。6.血管内皮细胞Nrf2缺失对荷瘤小鼠体内肿瘤细胞凋亡水平的影响:为了检测肿瘤细胞凋亡的情况,我们提取了肿瘤组织蛋白,检测了cleaved Caspase-3的蛋白水平,发现在Nrf2(E)-KO和Nrf2(E)-KI小鼠肿瘤之间,cleaved Caspase-3的蛋白水平无显著差异(P>0.05),这表明血管内皮细胞Nrf2缺失未影响肿瘤细胞的凋亡。7.成功构建血管内皮细胞Nrf2沉默的细胞系:为了进一步探究血管内皮细胞Nrf2参与肿瘤血管新生及肿瘤生长的可能机制,我们构建了Nrf2稳转沉默的SVEC4-10细胞系,并从m RNA及蛋白水平验证了Nrf2稳转沉默的SVEC4-10细胞系构建成功。8.血管内皮细胞Nrf2沉默促进共培养条件下血管内皮细胞迁移:为了评估肿瘤环境中血管内皮细胞的迁移能力,我们采用孔径为0.4μm的Transwell小室建立共培养体系,将3LL细胞接种到上室,并将SVECs接种到下室。共培养体系中的3LL细胞和SVECs是分离的,但细胞因子和生长因子能够相互通信。通过检测与3LL细胞接触48小时后的血管内皮细胞迁出小室的细胞数目,我们发现在与肿瘤细胞共培养后,Nrf2-KD组的血管内皮细胞迁移明显多于Scramble组(P<0.05)。9.血管内皮细胞Nrf2沉默促进共培养条件下VEGFR2和ERK磷酸化:为了评估与肿瘤细胞共培养环境中血管内皮细胞VEGFR2和ERK的活化水平,我们收集了培养3LL细胞24 h后的培养液上清,同时处理Scramble组和Nrf2-KD组血管内皮细胞5、10、20 min,我们发现Nrf2-KD组VEGFR2和ERK的磷酸化水平较高(P<0.05)。结论:1.血管内皮细胞特异性Nrf2缺失促进皮下肺癌细胞荷瘤小鼠肿瘤血管新生和肿瘤生长;2.血管内皮细胞Nrf2沉默在与肿瘤细胞共培养环境中可能通过提升VEGFR2和ERK的磷酸化水平促进细胞迁移。