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α-酮异己酸是亮氨酸的前体物质,可以广泛用于保健食品、饲料、医药当中。然而,化学法合成存在催化剂价格昂贵、需要特殊的起始物质的问题,导致α-酮异己酸成本较高,限制了α-酮异己酸的应用。利用L-氨基酸脱氨酶（L-AAD）可以将底物L-亮氨酸脱氨合成α-酮异己酸,但是目前对L-AAD的性质、定位位置、关键位点的功能研究较少,也无法满足工业化合成α-酮异己酸的需要。因此,在本论文中,通过在Escherichia coli BL21（DE3）中表达来自Proteus vulgaris的膜结合型L-AAD,探究其酶学性质及定位,并通过转化条件优化、表达调控元件优化、热稳定性改造等策略,进一步提高α-酮异己酸产量,以满足大规模生产和应用的需求。主要结果如下:（1）在E.coli BL21（DE3）中异源表达来自P.vulgaris的L-AAD。通过优化纯化过程中的去垢剂、硫酸铵、稳定剂等条件,用镍柱纯化200倍后,获得纯的L-AAD,比酶活为1.36μmol·min-1·mg-1。L-AAD的最适反应pH为8.5,最适反应温度为35°C,多数金属离子会抑制L-AAD的酶活,在Zn2+、Cu2+、Al3+、Cu2+存在下,酶活降低60%以上。L-AAD的抗氧化性较差,在2000μmol·L-1 H2O2存在时,酶完全失活。无细胞膜时,纯酶可以发生典型氧化脱氨反应产生H2O2,在有细胞膜存在条件下L-AAD脱氨不产生H2O2。通过计算机模拟,确定活性中心的Y97,Q99,Q278,Q280,R315,M411,G437,W438与催化活性密切相关。（2）通过转录水平分析,确定L-AAD的跨膜途径为依赖Tat的TypeⅡ途径。结合生物信息学、Western blot和催化产物分析,确定L-AAD锚定于细胞膜上,催化活性中心位于细胞膜外。采用表面活性剂（四氯化碳、SDS、吐温20、吐温80、曲拉通X-100）和有机溶剂（甲苯、康烷、丙酮）改变细胞膜性质,发现在1%甲苯处理30 min时,催化效率提高37.03%。进一步分析发现细胞膜通透性和质子电位改变会影响L-AAD的催化效率。（3）优化全细胞转化的条件,一步转化法合成α-酮异己酸。为了降低生产成本,优化菌体制备中乳糖诱导条件,在0.5 g·L-1的乳糖诱导时催化效率最高。全细胞转化过程的最优条件为:0.8 g·L-1菌体,20μmol?L-1转运抑制剂CCCP,100 mmol?L-1底物L-亮氨酸,最适pH 7.5,催化温度35°C,反应时间16 h。在分批转化中,最佳底物浓度为52.4 g·L-1,α-酮异己酸达到50.02 g·L-1,转化率达到95.97%。在流加底物转化中,最佳底物流加速率为6.55 g·L-1·h-1,α-酮异己酸产量在20 h时为69.06 g·L-1,转化率为50.31%。进一步通过固定化手段提高菌体再利用效率、pH稳定性和温度稳定性,固定化菌体再利用效率提高19.24%,在高温条件下（45°C）固定化细胞的催化活力提高2.2倍。（4）为了进一步提高L-AAD的表达量,基于热力学方程,在编码区和非编码区设计mRNA自由能,影响翻译起始速率,结合质粒拷贝数对转录的影响,调控转录水平。经过N端密码子替换后,A2密码子由GCG变成GCT,最小折叠自由能由-4.3 kcal·mol-1提高到-3.4 kcal·mol-1,酶活力提高24.89%。最大产量达到80.29 g·L-1,转化率为87.42%,比对照菌的转化率提高16.19%。通过非编码区的RBS序列优化,突变体BL21/RBS6的产量最大,达到81.41g·L-1,亮氨酸转化率达到88.66%。通过优化质粒拷贝数,BL21/pACYCDuet-lad的催化活力最大,产量达到76.47 g·L-1。组合转录和翻译最优条件,发现在最优转录条件（pACYCDuet-1）的质粒上表达RBS调控最优条件（RBS6）的序列条件下,催化效率相对单一策略BL21/pACYCDuet-lad和BL21/RBS6的全细胞催化效率分别提高31.20%和51.50%。α-酮异己酸的最大产量达到86.55 g·L-1,转化率达到94.25%。（5）通过分子动力学和蛋白折叠自由能理性设计,确定7个柔性氨基酸位点,经过高通量筛选饱和突变文库后,发现D340位点和L363位点为影响热稳定性的关键性位点。突变体D340N和L363N在37°C下,半衰期比野生型提高42%和12%。但是分子动力学模拟及分子运动轨迹分析发现D340N和L363N并不能提高蛋白整体和loop环的稳定性。在结构上D340位点和L363位点位于细胞膜插入域中,由突变引起的氨基酸的类型变化和带电变化分析发现D340N和L363N主要是通过提高蛋白与膜结合稳定性,进而提高催化稳定性。