论文部分内容阅读
目的:采用缺氧类诱导物氯化钴(化学式为CoCl2)处理HepG2细胞,在体外模拟肿瘤缺氧的状态,研究和探讨酸性神经酰胺酶(acid ceramidase,ASAH1)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在缺氧诱导HepG2细胞凋亡中所起到的作用及其关系。方法:选取肝癌细胞株HepG2细胞,按实验室常规培养1周左右,留取生长良好、处在对数期的HepG2细胞来进行正式的实验。分组如下:正常对照组(未经CoCl2处理)、CoCl2处理组(分别为200μM、400μM、600μM)和ASAH1的抑制剂处理组(即NOE,B13和C6-cer分别联合200μM CoCl2)。按照以上的分组及相应的试剂处理24 h后,分别检测各组HepG2细胞增殖情况(用四甲基偶氮唑盐微量比色法,MTT),细胞凋亡(用流式细胞仪,Flow cytometry);分别收集各组HepG2细胞并提取总蛋白(用蛋白裂解法,强RIPA裂解液);分别检测各组提取样品ASAH1和Caspase-3在蛋白上表达水平(用蛋白免疫印迹技术,Western Blot),所获结果进行灰度扫描(用Image–J软件)并进行统计分析。结果:(1)对于未经ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞增殖与凋亡情况:与正常对照组相比,处理细胞的CoCl2浓度逐渐增加(代表缺氧程度加重),HepG2细胞增殖能力显著降低(p<0.05),HepG2细胞凋亡情况(早期凋亡+晚期凋亡)则显著增加(p<0.05)。(2)对于经过ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞增殖与凋亡情况:抑制剂与CoCl2联合处理HepG2细胞,细胞增殖能力明显降低(p<0.05),细胞凋亡显著增加(p<0.05)。(3)对于未经ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞ASAH1和活性的Caspase-3蛋白的表达变化情况:处理细胞的CoCl2浓度增加(代表缺氧程度加重),ASAH1蛋白的表达呈递减趋势(p<0.05),其在200μM CoCl2组的表达比正常对照组要稍高些,Akt蛋白的表达也呈现递减的趋势(p<0.05),同时,活性的Caspase-3蛋白表达增加(p<0.05)。(4)对于经过ASAH1抑制剂处理,各组HepG2细胞中active Caspase-3蛋白的表达变化:ASAH1抑制剂B13和C6-cer联合200μM CoCl2处理的HepG2细胞,其active Caspase-3的蛋白的表达高于正常对照组和单个抑制剂处理组(p<0.05),但经过ASAH1抑制剂NOE联合200μM CoCl2处理的HepG2细胞,其active Caspase-3蛋白的表达比正常对照组低。结论:(1)化学性缺氧诱导物CoCl2能够在体外较好的模拟肿瘤细胞缺氧的状态,能够建立稳定的缺氧细胞模型。(2)在缺氧微环境中,ASAH1可以调控HepG2细胞的凋亡。(3)在缺氧微环境中,active Caspase-3可以介导HepG2细胞的凋亡。(4)在缺氧状态环境中,ASAH1可能是通过线粒体途径经由Akt蛋白发挥作用继而激活Caspase-3蛋白酶,最终引起细胞凋亡。(5)对肿瘤缺氧微环境的干预有一定的指导作用,为治疗肝脏实质性肿瘤提供奠定一定基础。