目的:采用缺氧类诱导物氯化钴（化学式为CoCl₂）处理HepG2细胞,在体外模拟肿瘤缺氧的状态,研究和探讨酸性神经酰胺酶（acid ceramidase,ASAH1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）在缺氧诱导HepG2细胞凋亡中所起到的作用及其关系。方法:选取肝癌细胞株HepG2细胞,按实验室常规培养1周左右,留取生长良好、处在对数期的HepG2细胞来进行正式的实验。分组如下:正常对照组（未经CoCl₂处理）、CoCl₂处理组（分别为200μM、400μM、600μM）和ASAH1的抑制剂处理组（即NOE,B13和C6-cer分别联合200μM CoCl₂）。按照以上的分组及相应的试剂处理24 h后,分别检测各组HepG2细胞增殖情况（用四甲基偶氮唑盐微量比色法,MTT）,细胞凋亡（用流式细胞仪,Flow cytometry）;分别收集各组HepG2细胞并提取总蛋白（用蛋白裂解法,强RIPA裂解液）;分别检测各组提取样品ASAH1和Caspase-3在蛋白上表达水平（用蛋白免疫印迹技术,Western Blot）,所获结果进行灰度扫描（用Image–J软件）并进行统计分析。结果:（1）对于未经ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞增殖与凋亡情况:与正常对照组相比,处理细胞的CoCl₂浓度逐渐增加（代表缺氧程度加重）,HepG2细胞增殖能力显著降低（p<0.05）,HepG2细胞凋亡情况（早期凋亡+晚期凋亡）则显著增加（p<0.05）。（2）对于经过ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞增殖与凋亡情况:抑制剂与CoCl₂联合处理HepG2细胞,细胞增殖能力明显降低（p<0.05）,细胞凋亡显著增加（p<0.05）。（3）对于未经ASAH1抑制剂处理,HepG2细胞ASAH1和活性的Caspase-3蛋白的表达变化情况:处理细胞的CoCl₂浓度增加（代表缺氧程度加重）,ASAH1蛋白的表达呈递减趋势（p<0.05）,其在200μM CoCl₂组的表达比正常对照组要稍高些,Akt蛋白的表达也呈现递减的趋势（p<0.05）,同时,活性的Caspase-3蛋白表达增加（p<0.05）。（4）对于经过ASAH1抑制剂处理,各组HepG2细胞中active Caspase-3蛋白的表达变化:ASAH1抑制剂B13和C6-cer联合200μM CoCl₂处理的HepG2细胞,其active Caspase-3的蛋白的表达高于正常对照组和单个抑制剂处理组（p<0.05）,但经过ASAH1抑制剂NOE联合200μM CoCl₂处理的HepG2细胞,其active Caspase-3蛋白的表达比正常对照组低。结论:（1）化学性缺氧诱导物CoCl₂能够在体外较好的模拟肿瘤细胞缺氧的状态,能够建立稳定的缺氧细胞模型。（2）在缺氧微环境中,ASAH1可以调控HepG2细胞的凋亡。（3）在缺氧微环境中,active Caspase-3可以介导HepG2细胞的凋亡。（4）在缺氧状态环境中,ASAH1可能是通过线粒体途径经由Akt蛋白发挥作用继而激活Caspase-3蛋白酶,最终引起细胞凋亡。（5）对肿瘤缺氧微环境的干预有一定的指导作用,为治疗肝脏实质性肿瘤提供奠定一定基础。