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目的:在整体及细胞水平研究黄芩苷对缺血性脑神经元损伤的保护作用,并探讨其激活MRTF-A介导的抗过氧化氢诱导的皮层神经元凋亡的机制。方法:1.黄芩苷对右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)/再灌注损伤大鼠脑神经功能、脑梗塞体积的影响:36只雄性成年SD大鼠(250-300g)随机分成6组:黄芩苷低中高剂量组(50,100和200mg/kg,腹腔注射)、尼莫地平组(阳性对组,0.4mg/kg,腹腔注射)、模型组(等量生理盐水、腹腔注射)及正常对照组(等量生理盐水、腹腔注射)。在行MCAO手术前,按分组要求分别腹腔注射黄芩苷及生理盐水,连续给药3天。3天后,对模型组、黄芩苷高中低剂量组及尼莫地平组大鼠进行MCAO手术。2小时后,抽出尼龙丝进行24小时再灌注。用Longa法对大鼠进行神经功能缺损评分;取脑组织,用TTC染色评价脑梗塞体积损伤程度;采用Western blot和RT-PCR检测脑组织中BCL-2及MCL-1表达水平;采用免疫荧光法检测脑组织中MRTF-A的表达。2.黄芩苷激活MRTF-A介导抗过氧化氢(H2O2)诱导神经元凋亡作用及机制:转染MRTF-AsiRNA至体外培养大鼠原代皮层神经元,48小时后,用黄芩苷(0.7μM、1.4μM、2.8μM)干预神经元。24小时后,用H2O2(800μM)处理细胞30min。采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,用Western blot和RT-PCR检测BCL-2及MCL-1表达水平,以此在细胞水平证明黄芩苷抗H2O2诱导神经元凋亡作用是通过MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的表达实现的;在此基础上,构建启动子含CArG box的BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突变体mut BCL-2-luc及mut MCL-1-luc报告基因质粒,并转染至体外培养大鼠原代皮层神经元中,48小时后,用黄芩苷(0.7μM、1.4μM、2.8μM)干预神经元。同样用H2O2(800μM)处理细胞30min。采用荧光素酶检测法检测其活性,以此证明黄芩苷介导MRTF-A的转录激活作用与MRTF-A作用于BCL-2及MCL-1启动子上的CArG box有关。3.黄芩苷激活MRTF-A介导的抗H2O2诱导神经元凋亡作用及对BCL-2及MCL-1基因的转录激活作用可能与其激活PI3K、ERK1/2信号通路有关:体外培养大鼠原代皮层神经元,转染BCL-2-luc及MCL-1-luc及其突变体报告基因质粒至皮层神经元中,48小时后,用PI3K抑制剂(LY29004)和ERK1/2(PD98059)处理细胞。12小时后,用黄芩苷(0.7μM、1.4μM、2.8μM)干预细胞。24小时后,用H2O2(800μM)处理细胞30min。采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;Western blot检测MRTF-A表达水平;采用荧光素酶检测法检测BCL-2-及MCL-1-luc活性。结果:1.在整体水平证明了黄芩苷能减少MCAO/再灌注引起的大鼠脑组织损伤:大鼠脑MCAO2h再灌注24h后,TTC染色显示黄芩苷(100和200mg/kg)处理组大鼠脑梗死区体积分别为20.71±9.79和11.55±5.09mm3,模型组脑梗死区体积为39.34±7.32mm3,与模型组比较,黄芩苷组脑梗死区体积明显减小(p<0.05或p<0.01);Longa法神经功能缺损评分显示:黄芩苷(100和200mg/kg)处理组评分明显低于模型组(p<0.05或p<0.01);Western blot和RT-PCR检测结果表明,与模型组相比较,黄芩苷(100和200mg/kg)处理组大鼠脑组织的BCL-2及MCL-1表达水平显著高于模型组(p<0.05或p<0.01);激光共聚焦检测发现黄芩苷处理组(100和200mg/kg)大鼠缺血侧脑组织的凋亡细胞明数明显少于模型组;免疫荧光观察发现在黄芩苷处理组(100和200mg/kg)的大鼠脑组织中MRTF-A的表达明显高于模型组,且显示黄芩苷可能促进了MRTF-A从胞浆向细胞核的转移。2.在细胞水平证明了黄芩苷抗H2O2诱导神经元凋亡作用是通过MRTF-A激活BCL-2及MCL-1的转录表达实现的:黄芩苷(0.7μM、1.4μM、2.8μM)干预神经元24h,H2O2(800μM)处理细胞30min,FCM结果显示模型组神经细胞凋亡率显著高于空白对照组,黄芩苷(1.4μM、2.8μM)干预组的凋亡率明显下降(p<0.05或p<0.01),而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化;Western blot和RT-PCR显示BCL-2及MCL-1表达随黄芩苷浓度(1.4μM、2.8μM)增加而增加(p<0.05或p<0.01),而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化;荧光素酶检测法检测到BCL-2-及MCL-1-luc活性随黄芩苷浓度增加而增强(p<0.05或p<0.01),而MRTF-A siRNA组则没有观察到此变化。3.在细胞水平证明了黄芩苷激活MRTF-A介导的抗H2O2诱导神经元凋亡作用及对BCL-2及MCL-1基因的转录激活作用可能与其激活PI3K、ERK1/2信号通路有关:FCM结果显示模型组神经细胞凋亡率显著高于空白对照组(p<0.01);黄芩苷(1.4μM、2.8μM)干预组的凋亡率分别为28.0%±2.10和14.1%±1.50,明显低于模型组(p<0.01);用PI3K抑制剂(LY29004)或ERK1/2(PD98059)干预后,其凋亡率分别为38.4%±4.33、36.6%±4.10和29.7%±3.95,与对应的黄芩苷组比较,其凋亡率明显升高,与黄芩苷中高剂量对应组间比较,具有统计学差异(p<0.05或p<0.01);Western blot显示:MRTF-A表达随黄芩苷浓度增加而增加,与模型组比较具有显著性差异(p<0.05或p<0.01),而用PI3K抑制剂(LY29004)或ERK1/2(PD98059)干预后,MRTF-A表达又下降,与黄芩苷中高剂量对应组间比较,具有统计学差异(p<0.05);荧光素酶检测法检测到BCL-2-及MCL-1启动子转录活性发现,PI3K抑制剂(LY29004)或ERK1/2(PD98059)能够逆转黄芩苷对BCL-2-及MCL-1启动子转录活性的影响,与其对应剂量组间比较具有统计学差异(p<0.05或p<0.01)。结论:1.在整体动物水平,证明了黄芩苷可以明显改善MCAO/再灌注诱导的神经功能损伤,减少脑梗塞体积,且能增强缺血侧脑组织中MRTF-A的表达及核转移。2.在细胞水平,证明了黄芩苷抗H2O2诱导皮层神经元凋亡作用是与其激活MRTF-A表达有关;黄芩苷能通过激活内源性MRTF-A表达上调皮层神经元中抗凋亡基因BCL-2及MCL-1的转录表达,且该作用与MRTF-A激活BCL-2及MCL-1启动子CArG盒的转录活性有关。3.在细胞水平,证明了黄芩苷抑制H2O2诱导的皮层神经元凋亡及激活MRTF-A介导BCL-2和MCL-1表达的上调可能与PI3K和ERK1/2信号通路相关。