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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种病毒性传染病。2011年以后PRV在我国大面积流行,传统的弱毒疫苗Bartha-K61已经不能实现对PR的完全保护。本文旨在探究核苷酸外焦磷酸酶磷酸二酯酶1(Ectonucleotide pyrophosphotase phosphodiesterase 1,ENPP1)在PRV感染触发的天然免疫应答中的作用机制,以期为PR防控奠定理论基础。环鸟苷单磷酸腺苷(Cyclic GMP-AMP,cGAMP)能够被环鸟苷单磷酸腺苷合成酶(Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)催化合成。它在PRV触发的天然免疫应答中发挥第二信使作用,最终激活干扰素(Interferon,IFN)信号通路。而ENPP1是一种II型跨膜蛋白且能够水解cGAMP。由此推测,ENPP1与PRV感染触发的天然免疫之间存在一定的联系。本研究采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测了猪ENPP1 m RNA在不同组织和细胞中的表达情况,发现在肌肉组织和PK15细胞中ENPP1 m RNA表达量最高。为了确定ENPP1是否影响PRV感染触发的宿主细胞天然免疫应答,首先,本研究分别构建了野生型ENPP1(ENPP1 WT)羧基端融合Flag标签的过表达载体、缺失核苷酸酶样结构域(ENPP1 aa.1-472)的截短型ENPP1过表达载体以及催化结构域和核苷酸酶样结构域同时缺失(ENPP1 aa.1-123)的截短型ENPP1过表达载体,用于探究ENPP1结构域对PRV感染的影响。其次,运用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)敲减ENPP1,检测PRV感染宿主细胞触发的天然免疫应答变化。为了深入阐明ENPP1参与PRV感染的具体分子机制,在HEK293细胞中过表达ENPP1 WT、ENPP1 aa.1-472、ENPP1 aa.1-123载体后,感染PRV或转染c GAMP,利用免疫印迹分析法和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)分别检测干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)的活化和干扰素β(Interferonβ,IFN-β)的分泌情况。研究结果表明,重组PRV(PRV-GFP)感染ENPP1 WT和ENPP1 aa.1-472过表达的3D4/21细胞36 h后,细胞的荧光强度与对照相比显著增强,但ENPP1 aa.1-123过表达的细胞无显著变化。为了证实ENPP1过表达增强PRV感染,使用WT PRV毒株(PRV QXX)感染不同ENPP1变体过表达的3D4/21细胞24小时后,检测病毒滴度和IFN mRNA表达变化发现:过表达ENPP1 WT或ENPP1 aa.1-472的3D4/21细胞的病毒滴度显著上调,同时病毒感染引起细胞中干扰素β(IFN-β)m RNA的表达量也显著增加。而空载体或ENPP1 aa.1-123过表达对QXX滴度和IFN m RNA表达量没有影响。这些结果说明ENPP1过表达促进PRV感染。与对照相比,PRV QXX感染ENPP1 WT和ENPP1 aa.1-472过表达的3D4/21细胞,IFN-β和核因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)启动子活性显著减弱。而ENPP1 aa.1-123过表达对IFN-β和NF-κB启动子活性没有影响。以上研究结果表明,ENPP1过表达促进PRV感染并抑制IFN-β和NF-κB的转录,该抑制作用依赖ENPP1的催化结构域。其次,用对照siRNA(siControl)和特异性针对ENPP1 mRNA的三种不同siRNA(siENPP1-1、siENPP1-2和siENPP1-3),瞬时转染PK15细胞24、48或72 h,通过q RT-PCR检测ENPP1 mRNA表达量。结果显示,与用siControl或siENPP1-1转染的细胞相比,在siENPP1-2、siENPP1-3转染的细胞中,ENPP1 mRNA的敲减效率更高。ENPP1敲减的细胞感染PRV-GFP 36 h后,细胞的荧光强度与对照相比显著减弱。通过病毒滴度测定,ENPP1下调也减弱了PRV QXX感染。在未感染PRV QXX的PK15细胞中,经siENPP1-2或siENPP1-3转染敲减ENPP1后不影响IFN-βmRNA水平。然而,与用siControl转染的细胞相比,用siENPP1-2或siENPP1-3转染的细胞中PRV QXX感染诱导IFN-βmRNA水平显著升高。尽管PRV QXX感染增加了siControl转染细胞中IFN-β和NF-κB的启动子活性,但在ENPP1敲减细胞中检测到IFN-β和NF-κB启动子活性的显著增强。上述结果证明敲减ENPP1抑制PRV复制并促进IFN-β和NF-κB的转录。最后,在HEK293细胞中过表达ENPP1 WT、ENPP1 aa.1-472、ENPP1 aa.1-123。ENPP1在PRV感染过程中的分子机制研究表明,未感染PRV QXX或未转染c GAMP的细胞IFN-β分泌的趋势和IRF3激活的趋势与空载体一致。但PRV QXX感染24 h或cGAMP转染6 h后,ENPP1 WT和ENPP1aa.1-472过表达的细胞与空载体或ENPP1 aa.1-123过表达细胞相比,PRV QXX感染或cGAMP转染诱导的IRF3磷酸化被显著抑制,IFN-β的分泌减少。上述结果表明,ENPP1抑制PRV感染或c GAMP转染诱导的细胞中IRF3的磷酸化,并降低IFN-β分泌,在此过程中其催化结构域起关键作用。综上所述,猪ENPP1参与PRV感染触发的天然免疫应答反应。ENPP1抑制PRV或cGAMP诱导的IRF3磷酸化,并降低IFN-β分泌。ENPP1参与PRV感染触发的天然免疫应答反应中,其催化结构域起关键作用。本研究结果将为PRV的防控提供基础理论依据。