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肿瘤细胞代谢异常是肿瘤的重大特征之一。肿瘤细胞中特定代谢酶的基因突变或者表达异常,能够诱导肿瘤的代谢重编程,促进肿瘤的发生发展。三磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）是内源性丝氨酸合成的关键限速酶,催化糖酵解中间产物3-磷酸甘油生成3-磷酸羟基丙酮酸,通过合成丝氨酸供给细胞内核苷酸与脂肪酸等的生物合成。最近的研究表明,PHGDH在乳腺癌、肺癌等多种肿瘤中扩增或异常高表达,为肿瘤的快速增殖提供核苷酸等生物大分子物质,在肿瘤的发生发展过程中发挥了关键作用。当前,PHGDH已成为肿瘤代谢领域备受关注的靶点之一。目前已报道的PHGDH抑制剂主要分为正构抑制剂与变构抑制剂,现有的两类抑制剂均存在明显的问题:1)正构抑制剂在分子水平活性较好,但细胞水平抗肿瘤效果欠佳;2)变构抑制剂在分子水平对酶活的抑制作用不如正构抑制剂,但细胞水平活性却更好,由于大多结合位点并不明确,机制不明。现有的PHGDH抑制剂的抗肿瘤作用极其有限,目前尚未有候选化合物进入临床研究阶段。基于上述研究现状,本论文旨在发现活性更优的PHGDH抑制剂,克服当前抑制剂细胞活性不佳的瓶颈,并为PHGDH抑制剂的研发提供新的分子骨架与设计思路。因此,本课题组与药物化学家合作,平行采用化合物库筛选和计算机辅助药物设计两种策略,寻找新型结构骨架且具良好活性的PHGDH抑制剂。通过上述两种策略,我们初步筛选得到两个活性较佳的化合物GDD-04-35、FKR-06-92,随后对二者进行分子水平、细胞水平或动物水平的综合性评价,并对化合物作用机制进行了初步探索。第一部分工作,我们对化合物库筛选获得的化合物GDD-04-35进行了综合评价。在分子水平,该化合物对PHGDH具有与现有阳性药CRB-5884活性相当的酶活抑制作用。在细胞水平,GDD-04-35对肿瘤细胞的生长抑制作用明显优于阳性药,胞内药物浓度检测提示这一优势可能与其细胞内药物作用时间较长有关。接下来,我们探索了GDD-04-35如何抑制PHGDH,分别通过底物3-磷酸甘油酸（3-PG）和辅因子NAD+的竞争实验,明确GDD-04-35是NAD+的竞争性抑制剂。为了进一步明确GDD-04-35在PHGDH上的结合位点,我们利用GDD-04-35与PHGDH蛋白的共结晶实验,初步明确GDD-04-35结合于PHGDH上NAD+的结合口袋,与该口袋的175位天冬氨酸存在显著的相互作用。随后通过GDD-04-35对关键结合位点突变的PHGDH的酶活抑制实验,确证了GDD-04-35通过与175位点结合发挥酶活抑制作用。接下来,我们对化合物在细胞水平的作用机制进行初步探索,证实了GDD-04-35降低肿瘤细胞内葡萄糖来源的丝氨酸从头合成,引起肿瘤细胞发生G1期阻滞。此外,我们拓展了多株不同PHGDH背景的肿瘤细胞株,进一步明确GDD-04-35选择性抑制PHGDH扩增或者高表达的肿瘤细胞株。最后,在体内裸小鼠移植瘤模型抗肿瘤活性评价中,GDD-04-35也表现出良好的体内抗肿瘤作用。在第二部分工作中,针对虚拟筛选获得的候选化合物FKR-06-92,我们利用与上述相似的研究策略,开展了系统研究。酶活评价的结果发现FKR-06-92对PHGHD具有较强的酶抑制活性,底物竞争和分子对接研究等研究揭示了FKR-06-92在靶细胞中的结合模式,表明其可作为NAD+竞争性抑制剂。FKR-06-92对胞内丝氨酸的从头合成有显著的抑制作用,并且可以诱导细胞周期阻滞和凋亡抑制肿瘤细胞的生长。与上述结果一致,与PHGDH非依赖性细胞相比,FKR-06-92可以选择性地抑制PHGDH依赖性肿瘤细胞的生长。最后,我们对GDD-04-35及FKR-06-92进行了综合比较和分析,拟为PHGDH抑制剂的研发提供进一步的指导。在作用模式与作用位点上,GDD-04-35和FKR-06-92都是NAD+竞争性PHGDH抑制剂,二者都与PHGDH的175位天冬氨酸结合。此外,二者具有良好的PHGDH酶活抑制活性和肿瘤细胞抑制活性,并都表现出对PHGDH高表达的肿瘤细胞的选择性抑制作用。不过总体而言,GDD-04-35表现出相对FKR-06-92略强的PHGDH抑制活性与抗肿瘤作用。通过比较二者的结构发现,尽管化合物来源不同、化合物骨架存在差异,但二者都通过一个磺酰胺基团和一个酰胺基团与PHGDH形成氢键,同时磺酰胺基团和酰胺基团在这两个化合物中的空间距离也相近,这可能预示了以该类官能团为核心研发PHGDH抑制剂的巨大潜力。至于二者活性差异则可能与支链的差异有关,提示对支链的结构改造可成为进一步提高该类化合物活性的有效策略。综上所述,本论文采用两种抑制剂发现策略,与药物化学家合作发现了两个具有进一步研究价值的PHGDH抑制剂GDD-04-35及FKR-06-92,克服了当前PHGDH竞争性抑制剂细胞活性差的瓶颈,为抗肿瘤治疗提供有效的PHGDH竞争性抑制剂候选化合物。此外,本文初步阐明了二者与PHGDH的结合方式和作用机制,为认识抑制剂与PHGDH的作用提供理论基础,也为PHGDH抑制剂研发提供新型的化学结构基础与理论指导。