【摘 要】
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目的:SOD1基因突变是肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）的常见突变,明确在稳定转染SOD1 G93A NSC34细胞中Orai1通过CREB调控MCU参与ALS发病情况。方法:1.应用慢病毒转染技术得到稳定转染的SOD1 G93A NSC34细胞,并以免疫荧光及q RT-PCR法检测转染效率。2.无药物干预分组:应用Western blot、免
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目的:SOD1基因突变是肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis,ALS）的常见突变,明确在稳定转染SOD1 G93A NSC34细胞中Orai1通过CREB调控MCU参与ALS发病情况。方法:1.应用慢病毒转染技术得到稳定转染的SOD1 G93A NSC34细胞,并以免疫荧光及q RT-PCR法检测转染效率。2.无药物干预分组:应用Western blot、免疫荧光染色方法,检测在NSC34细胞、SOD1 G93A NSC34细胞中Orai1、P-CREB、MCU、CREB等蛋白的表达情况。3.药物干预后分组:在稳定转染的SOD1 G93A NSC34细胞中,应用Orai1蛋白的抑制剂（MRS1845,MRS）、MCU蛋白的激动剂（Spermine,SPE）,行Western blot、免疫荧光染色方法,检测在各组细胞中Orai1、P-CREB、MCU、CREB等蛋白的表达情况,实验分组为:SOD1 G93A NSC34细胞组、SOD1 G93A NSC34+MRS组、SOD1 G93A NSC34+SPE组、SOD1 G93A NSC34+MRS+SPE组。4.细胞活性的影响:在SOD1 G93A NSC34细胞组、SOD1 G93A NSC34+MRS组、SOD1 G93A NSC34+SPE组采用CCK8法检测细胞活性。结果:1.无药物干预分组结果:Western blot结果显示:Orai1蛋白、P-CREB蛋白以及MCU蛋白表达在SOD1 G93A NSC34细胞组中表达高于NSC34细胞组（P＜0.05）;在免疫荧光染色中,Orai1蛋白、P-CREB蛋白以及MCU蛋白荧光强度差异与Western blot结果一致（P＜0.05）;2.药物干预后分组结果:与SOD1 G93A NSC34细胞组相比,SOD1 G93A NSC34+MRS组中Orai1蛋白、P-CREB蛋白以及MCU蛋白的表达量明显降低（P＜0.05）;SOD1 G93A NSC34+SPE组Orai1蛋白、P-CREB蛋白未见明显差异,而MCU蛋白表达量则呈现上升趋势（P＜0.05）;SOD1 G93A NSC34+MRS+SPE组,Orai1蛋白、P-CREB蛋白表达量下降（P＜0.05）,同时MCU表达未见明显差异;在免疫荧光染色中,Orai1蛋白、P-CREB蛋白以及MCU蛋白荧光强度差异与Western blot结果一致（P＜0.05）;3.细胞活性实验结果:与SOD1 G93A NSC34细胞组相比,SOD1 G93A NSC34+MRS组细胞活性增强;SOD1 G93A NSC34+SPE组细胞活性减低（P＜0.05）。结论:Orai1、P-CREB、MCU蛋白高表达与SOD1 G93A NSC34细胞模型的发病机制相关;Orai1蛋白是通过调节CREB磷酸化程度来调控MCU蛋白的表达量参与SOD1G93A NSC34细胞模型的发病过程;沉默Orai1蛋白可以保护SOD1 G93A NSC34细胞模型的细胞活性。
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