背景与目的精神分裂症是以思维、情感及行为的分裂,精神活动与环境不协调为主要特征的一类重型慢性精神病,多青壮年发病,该病的人群发病率大概为1%,同时它也是一种遗传度为0.70-0.85的复杂多基因遗传病。虽然该病为遗传相关性疾病,但是和其他遗传病相比,如乳腺癌、阿尔茨海默病等,其并没有呈现出典型的孟德尔遗传方式。遗传与环境之间复杂的相互作用是精神分裂症的主要病因,但该病的确切发病机制现在仍不明确。通过多种研究发现多巴胺、谷氮酸和5-羟色胺等多种神经递质的异常与精神分裂症的发病相关,且找出了与精神分裂症相关的多个易感基因,比如GAD1、RELN, COMT, NR3Cl和本课题所研究的GABRB2基因等。GABRB2基因位于染色体5q34,由11个外显子组成,长度约为250-kb,编码γ-氨基丁酸A型受体β2亚基受体。该受体为中枢神经系统内的一种抑制性神经受体,在人类脑部广泛表达,尤其在小脑区域。其中γ.氨基丁酸(GABA)类神经递质和精神分裂症发病的相关性首次在1970年初被报道,随后有诸多的关于γ一氨基丁酸能系统异常与精神分裂症发病相关的研究。γ,一氨基丁酸A型受体(GABAA)是中枢神经系统中主要的抑制性神经能受体,该受体是一种多亚基氯化物通道,在中枢神经系统中介导快速突触抑制作用。在哺乳动物脑部有关GABA不同的亚型组合中,α1、β2、γ2受体为占主导地位的亚型受体。与GABRB2基因相关的研究中,位于该基因内的内含子7和内含子8的5个SNP位点首次被报道与精神分裂症相关。随后的研究进一步证明了该基因与精神分裂症的相关性。已有多个研究分别在多个人种中发现GABRB2的多态性与精神分裂症相关。同时研究发现GABRB2的内含子10的多态性与精神分裂症和双向情感障碍有关。在RNA水平,研究发现在精神分裂症患者尸检脑中GABRB2基因RNA异构体表达及选择性剪接相对于对照组有显著基因型依赖性的降低。在蛋白水平,GABRB2基因内外显子10上的DNA序列变异引发ATP依赖性的受体蛋白的电生理功能改变。任意的GABRB交叉结合型亚基的表达将会提高电生理特性对发病的影响,从而对精神分裂症的发病机制产生重要影响。另外,研究发现GABRB2在对照组中观察到的基因印记现象,在疾病组弱化了,进一步证实了精神分裂症易感基因GABRB2表观遗传调控的异常。在对精神分裂症同卵双生子的研究发现,其发病的不一致性、性别差异以及亲缘效应等现象一致说明了环境因素尤其是表观遗传因素在精神分裂症发病过程中起着重要的作用。且随着分子生物学的发展,表观遗传学在精神分裂症病因学研究中受到越来越多的重视。现有的研究中已有相关精神分裂症易感基因的表观遗传学研究,但主要体现在基因内甲基化水平,有关与DNA主动去甲基化过程相关的羟甲基化水平在2012年才初见报道。在表观遗传学中,甲基化体现为5mC,羟甲基化体现为5hmC,5hmC是DNA甲基化与去甲基化动态过程中的一个重要中间体,该动态过程的异常可导致多种疾病的发生,因此5hmC异常更表明表观遗传因素在精神分裂症病因学中的重要作用。现有的关于GABRB2基因的研究均是从传统的DNA变异和RNA表达变化的层次上去说明其与精神分裂症的相关性,但对同卵双生子精神分裂症患者的研究发现环境的因素对发病也起着重要的作用。因此从表观遗传学的角度去阐明其因环境的变化而发生的DNA表观修饰的改变与精神分裂症发病的相关性。将精神分裂症易感基因的甲基化研究同全基因组水平的甲基化结合起来,将有助于揭示DNA甲基化的调控机制,为临床的诊断和治疗提供靶点,从而能够更好地了解精神分裂症的发病及病情发展的过程,为精神分裂症的治疗提供更多的科学依据。本研究应用本课题组已建立的全基因组和特定位点5hmC及5mC的新检测技术,以中国汉族人群为对象,分析外周血基因组总水平、GABRB2的疾病易感区Alu-Yi6元件及启动子区5hmC及5mC修饰与精神分裂症的相关性,以及GABRB2基因启动子区变异的贡献率；并在细胞水平进一步揭示5hmC和5mC修饰调控GABRB2表达的机制,阐明DNA基因型、羟甲基化及甲基化修饰的相互作用机制及其在精神分裂症病因学中的重要作用,将为精神分裂症发病机制的研究开辟新思路和新途径。材料与方法1.实验材料：临床样本相关性分析：共收集172例偏执型精神分裂症外周血样本和167例正常人对照外周血样本。以标准的酚-氯仿方法抽提基因组DNA后溶于pH为8.0的TE溶液,测定浓度后-20℃保存备用。用于全基因组和特定位点的甲基化、羟甲基化检测以及启动子区SNP分析。启动子活性调控机制研究：采用HEK293(Human Embryonic Kidney293cell)细胞为转染细胞,PGL4为表达载体,双荧光报告基因检测系统检测启动子活性。表观遗传学药物调控基因表达机制研究：采用VPA (Valproic acid,丙戊酸钠)和AZA (5-aza-2’-deoxycytidine,5-氮杂-2’-脱氧胞苷)两种表观遗传学药物,IMR-32细胞(人神经母细胞瘤细胞)为药物研究细胞。2.实验方法(1)样本DNA的甲基化和羟甲基化检测：采用已有的基于荧光标记HpaⅡ-Mspl酶切产物并结合荧光偏振检测的全基因组范围内CCGG甲基化水平定量技术(FP based measurement of DNA methylation, FPDM)对收集的精神分裂症样本和对照样本进行全基因组甲基化(5mC)和羟甲基化(5hmC)检测；应用基于HpaⅡ-Mspl限制性内切酶结合荧光实时定量PCR的方法对GABRB2启动子区及疾病易感区Yi-Alu6元件内的甲基化和羟甲基化修饰进行定量分析。(2)临床样本GABRB2基因启动子区SNP分析：用sanger测序的方法对启动子区的SNP位点进行测序,并统计各个位点的基因型频率和等位基因频率,探讨各SNP位点与精神分裂症的相关性。(3) GABRB2基因启动子活性调控机制研究：检测临床样本实验中所得到的与疾病相关的CCGG位点中的“关键CpG靶点”在表观修饰改变后对启动子活性的调控作用；检测临床样本中所统计的SNPs位点SNPs基因型变化对启动子活性的调控作用。(4)表观遗传学药物调控GABRB2基因表达机制研究：用表观遗传学药物AZA和VPA对神经母细胞瘤细胞进行药物处理,检测该两种药物对GABRB2基因RNA表达和启动子区位点甲基化的影响,为精神分裂症的药物使用提供新的靶点。3.统计学分析：采用SPSS13.0的线性回归和协方差等统计方法分析全基因组和特定位点的甲基化和羟甲基化与精神分裂症的相关性。采用SHEsis软件分析SNPs基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律,运用SPSS13.0软件中的χ2检验比较病例和对照两组间等位基因和基因型频率的差异。应用SPSS13.0软件中的方差分析对细胞水平的调控作分析。4.结果(1)临床样本DNA的甲基化和羟甲基化检测结果：在对全基因组甲基化和羟甲基化与精神分裂症病相关的研究中发现病例组全基因组的甲基化和羟基化程度均显著高于对照组。同时病例组GABRB2基因内启动子区与疾病易感区Alu-Yi6元件的甲基化水平与全基因组的甲基化水平趋势一致。在病例组中特定位点的甲基化和羟甲基化程度均高于对照组。其中,甲基化水平除了启动子区的第一个区段两组间未有显著差异外,启动区的另一个区段与Alu区段的甲基化水平病例组均显著高于对照组；病例组的羟甲基化水平在启动子区均显著高于对照组,但Alu区段的羟甲基化水平在病例组和对照组中均较低,未达到可以检测的水平。(2)临床样本GABRB2基因启动子区SNP分析结果：启动子区SNP rs3811996的杂合基因型(A／G)频率在病例组中显著低于对照组；在男性样本中,其A／G基因型和次要等位基因G频率均显著低于对照组。(3) GABRB2基因启动子活性调控机制研究结果：突变在临床样本中所检测到的GABRB2基因启动子区四个与疾病相关的CpG位点,转染细胞检测后发现第二个CpG位点显著增加启动子活性。(4)表观遗传学药物调控GABRB2基因DNA修饰和RNA表达的研究结果：表观遗传学药物AZA降低启动子区甲基化和羟甲基化程度,增加GABRB2基因表达；表观遗传学药物VPA降低启动子区甲基化程度不明显,但显著增加GABRB2基因表达。5.结论(1)精神分裂症患者外周血全基因组甲基化水平可作为一个潜在的疾病发生和发展的监测因子。(2)位于GABRB2启动子区769-770bp的CpG位点为与精神分裂症相关的表观修饰靶点。(3)AZA通过降低DNA甲基化修饰增加GABRB2mRNA表达,可作为潜在的精神分裂症筛选药物。由结核分支杆菌引起的结核病是当今全球流行最广泛的传染病之一。近年来结核病疫情有重新上升的趋势,其主要原因之一就是耐多药结核病的流行。快速、准确的实现结核病耐药性检测将有助于从根本上控制该病的流行。本研究采用单碱基延伸-荧光偏振的DNA突变检测新技术(One label Extension-Fluorescence polarization, OLE-FP)对基于基因变异的结核耐药性临床样本进行快速分子诊断的相关研究。首先采集并分离来自广州地区对临床一线药物利福平、异烟肼具有耐药性的结核分枝杆菌,并在实验室中利用比例法和绝对浓度法对其药物的敏感性做进一步检测；其次,利用传统Sanger测序法对上述药物相关的标靶基因进行序列测定,并结合临床和实验室药敏结果,筛选出可用于耐药性诊断的功能性DNA变异；第三,建立OLE技术对上述耐药性功能变异的检测条件,进而对临床样本进行检测,并结合Sanger测序结果,进一步验证已建立的新方法准确性。