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目的构建热激启动子(p HSP,HSP Promoter)驱动的靶向敲低Polo样蛋白激酶1(PLK1)的真核表达质粒,并观察其对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响。方法首先合成热休克蛋白HSP70的启动子,克隆至带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达质粒p EGFP-C1中,利用热激启动子(p HSP)替换原有的CMV启动子,构建真核表达载体p HSP-GFP;其次,利用RNA干扰技术合成以PLK1基因为靶向目标的sh RNA,将其定向克隆至真核表达载体p HSP-GFP中形成重组质粒p HSP-sh PLK1-GFP;另外设计一组阴性对照质粒p HSP-NC-GFP,最后,利用脂质体Lipo2000转染的方法将质粒转染至U2OS细胞,非热激组细胞正常培养,热激组及阴性对照组细胞42℃加热2h,通过细胞免疫荧光染色实验检测GFP的表达,从而确定热激启动子的驱动能力,采用Quantitative real-time PCR的方法检测细胞内PLK1的m RNA表达水平,Western blotting技术检测PLK1蛋白表达水平,利用MTT法检测重组质粒对U2OS细胞增殖的影响。结果成功构建了热激启动子驱动的真核表达质粒p HSP-sh PLK1-GFP;细胞免疫荧光染色实验结果显示热激启动子可正常驱动GFP基因的表达,且GFP的蛋白定位在胞质中;Quantitative real-time PCR结果显示热激组细胞PLK1基因表达量明显降低,与非热激组及阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05);Western blotting结果显示热激组细胞PLK1蛋白表达量比非热激组及阴性对照组低(P<0.05);MTT结果显示热激组细胞的增殖活性被明显抑制,与非热激组及阴性对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论热激启动子驱动的真核表达质粒p HSP-sh PLK1-GFP能在U2OS细胞中表达,在42℃加热条件下,该重组质粒呈现更强的下调PLK1基因表达和抑制增殖作用。目的以趋磁细菌磁小体(Bacterial magnetosomes,BMs)为载体骨架,将热激启动子驱动的真核表达质粒p HSP-sh PLK1-GFP以及化疗药物阿霉素(DOX)偶联于载体材料上,制备新型纳米复合物BMs/p HSP-sh PLK1/DOX并检测其表征。方法通过改变趋磁细菌培养液中铁源、碳源以及氮源的种类和数量优化趋磁细菌AMB-1的培养条件;采用超声与磁铁吸附的方法分离纯化磁小体,在透射电镜下观察磁小体的形态特征;利用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)将重组质粒p HSP-sh PLK1-GFP和DOX偶联至磁小体构建复合物BMs/p HSP-sh PLK1/DOX,分别运用激光粒度仪和Zeta电位分析仪检测复合物的粒径及所带电荷;观察在交变磁场(alternating magnetic field,AMF)下复合物的产热效应及DOX的释放率;通过细胞免疫荧光实验检测复合物处理后骨肉瘤U2OS细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达分析该复合物的被摄取情况。结果趋磁细菌AMB-1的最佳生长条件为:以20μmol/L的硫酸亚铁为铁源,以800mg/L的硝酸钠为氮源,以200mg/L的琥珀酸为碳源;透射电镜显示提纯后的磁小体大小均匀,分散度好;复合物BMs/p HSP-sh PLK1/DOX的粒径为(129.5±9.7 nm),Zeta电位为(-11.7±2.9 m V);在交变磁场下,复合物可在3min之内升温至43℃,并可通过调控磁场强度维持30min,该条件下,DOX的释放率可达到54%;复合物处理后的细胞可见明显的GFP蛋白表达,从而证实U2OS细胞可有效摄取该复合物。结论成功制备趋磁细菌磁小体介导的纳米复合物BMs/p HSP-sh PLK1/DOX,该复合物有望成为治疗骨肉瘤的新型纳米药物。