【摘 要】
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目的:通过分析不同培养条件下c HSCs的体外增殖活性及干性基因的表达,尽可能真实的模拟体内c HSCs增殖的骨髓微环境,寻找更好的促进c HSCs体外增殖的方法,从而实现c HSCs的体外大量增殖。方法:（1）自健康犬骨髓中分离提取c BMSCs,培养至第3代应用流式细胞术鉴定细胞表面标记物。（2）自健康犬骨髓中分离提取c HSCs,用流式细胞仪分选纯化c HSCs。（3）CCK-8法测c HS
【基金项目】
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云南省朱兴全专家工作站（202005AF150041）； 云南农业大学兽医公共卫生省创新团队（202105AE160014）； 犬干细胞系列产品的研发与应用（2017530117000288）；
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目的:通过分析不同培养条件下c HSCs的体外增殖活性及干性基因的表达,尽可能真实的模拟体内c HSCs增殖的骨髓微环境,寻找更好的促进c HSCs体外增殖的方法,从而实现c HSCs的体外大量增殖。方法:（1）自健康犬骨髓中分离提取c BMSCs,培养至第3代应用流式细胞术鉴定细胞表面标记物。（2）自健康犬骨髓中分离提取c HSCs,用流式细胞仪分选纯化c HSCs。（3）CCK-8法测c HSCs培养至第6 d时不同培养基组、不同血清浓度组、不同细胞因子组和不同c BMSCs接种比例组c HSCs细胞增长活性OD值。（4）台盼蓝染色计数c HSCs+细胞因子组、c HSCs+c BMSCs组和c HSCs+c BMSCs+细胞因子组21 d细胞数量增长。（5）流式细胞术检测1-3代c HSCs细胞纯度。（6）荧光定量PCR法检测1-3代c HSCs干性基因SOX2和OCT-4的表达水平。结果:（1）分离得到c BMSCs,第5 d有少量长梭形贴壁细胞,第11 d细胞出现漩涡状生长,流式细胞术检测第3代细胞表面标记物。结果显示:c BMSCs分离培养第5 d出现不规则贴壁细胞,第11 d出现漩涡状均一长梭形贴壁细胞。流式细胞术检测第3代细胞得知CD44和CD90呈阳性表达,CD34、CD45和CD11a呈阴性表达,符合c BMSCs的特征。（2）分离得到c MNCs,抗体标记后流式分选纯化c HSCs细胞纯度为96.3%,显微镜下可见c HSCs呈圆形,大小均一,体积较小。（3）不同培养基组中DMEM/F12培养基细胞活性最低,RPMI 1640培养基细胞活性最好,三个组别之间没有统计学差异;不同血清浓度组中添加20%FBS组细胞活性最好,其次为15%、10%、5%FBS组,20%、15%均极显著高于5%组（P＜0.01）;不同细胞因子组中联合添加TPO+FLT-3+SCF+IL-6组极显著高于单独添加TPO组,显著高于TPO+FLT-3组（P＜0.05）;不同c BMSCs接种比例组中c HSCs:c BMSCs为1:10组极显著高于1:5组、5:1组和10:1组。（4）c HSCs+c BMSCs+细胞因子组21 d的细胞增长数量高于c HSCs+细胞因子组和c HSCs+c BMSCs组,其中c HSCs+c BMSCs+细胞因子组和c HSCs+c BMSCs组细胞数量均高于种板的数量。（5）1-3代c HSCs阳性百分率逐渐下降,由1代的57.6%下降到2代的33.7%再下降到3代的21.8%。（6）与原代c HSCs相比,1代、2代、3代c HSCs的干性基因SOX2m RNA转录水平均极显著低于原代组;1代、2代c HSCs的干性基因OCT-4m RNA转录水平均极显著高于原代组。结论:本研究结果表明使用添加10%FBS的IMDM培养基按照c HSCs:c BMSCs为1:10比例培养c HSCs并联合添加TPO+FLT-3+SCF+IL-6细胞因子在培养到1代时候的细胞增殖效率最高,从而实现c HSCs的体外大量增殖后用于临床。
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