研究背景:外固定架、植入式假肢及经皮植入假体等经皮植入物在临床上广泛应用。实现经皮部位的生物密封,提高其与机体的整合效果,从而减少感染的发生仍是亟待解决的关键问题。近年来,国内外研究者期望通过对经皮植入物表面进行改性和修饰,以解决上述问题。在本研究中,课题构建了微型沟槽图案化和金属-有机框架（Metal-organic framework,MOF）涂层两种方法,用 以修饰经皮植入钛合金材料表面,并通过体外、体内实验研究联合修饰方法对经皮植入钛合金材料的影响。目的:1.通过体外细胞学实验观察钛合金表面不同尺寸沟槽化修饰对成纤维细胞的影响,并优选出最佳沟槽修饰参数。2.通过在大动物体内不同植入部位的对比观察,建立经皮植入钛合金材料体内实验的大动物模型,并对经皮植入物进行优化设计。3.比较不同表面改性经皮植入钛合金材料在小香猪体内的整合效果。方法:第一部分1.委托中国科学院西安光学精密机械研究所完成钛合金材料表面的沟槽加工,按沟槽脊宽分为:5 0μm、80μm、100μm、150μm和200μm五个实验组（沟槽宽度均为50μm、深度均为10μm）,以及无沟槽对照组。2.各组钛片经表面处理后,通过扫描电子显微镜（Scanning electron microscope,SEM）观察其表面形貌特征并测量、确定沟槽尺寸参数。3.将NIH3T3成纤维细胞系培养,取第2代细胞接种于不同沟槽结构的钛合金材料。4.于接种培养的不同时段,通过SEM观察细胞黏附,并进行细胞增殖检测。5.使用鬼笔环肽-罗丹明对F-actin染色,用含DAPI的ProLong TMGold防淬灭剂对细胞核进行染色。采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架及黏着斑（Vinculin）表达情况,并对细胞极性进行分析。6.通过荧光显微镜,观察细胞成肌分化特性。第二部分1.在大动物体内,分别在髂骨、股骨外侧、胫骨外侧及胫骨内侧经皮植入钛合金材料,并通过比较确定最佳植入部位,建立经皮植入物体内研究大动物模型。2.测量各部位骨骼直径、皮肤至骨面距离,为体内实验确定相关指标参数。3.结合实验结果,通过不同直径植入物比较,分析并确定植入部位,并对植入物进行设计。第三部分1.根据第一、二部分实验结果,分别构建经皮植入钛合金材料,并完成经皮部分的微型沟槽图案加工。2.委托重庆大学生物工程学院完成植入物经皮部分的MOF涂层。体内实验共分4组,分别是:光滑表面组（AT-p）、沟槽表面组（AT-g）、沟槽表面联合MOF修饰组（AT-g-m）、光滑表面MOF修饰组（AT-m）。3.各组植入物经表面改性修饰后,分别通过SEM、三维表面形貌仪对其表面形貌特征进行观察和测量;通过光学接触角仪对其接触角进行测量,比较各样本间的亲水性。4.在小香猪体内进行四组不同表面改性经皮植入物的体内植入实验,分别通过大体观察植入后钉道周围变化,通过影像学观察置钉稳定性及脱落情况,通过全身血清学检测及局部分泌物状态判断感染情况,通过组织学检测判断内植物与机体的整合状态及内部感染情况。结果:第一部分1.SEM显示接种48h后,细胞黏附于钛片的沟脊部位;脊宽较小组（50-150μm）,细胞形态细长,并沿沟脊方向延伸生长。2.CCK-8提示不同脊宽对细胞增殖无显著影响（P＞0.05）。3.细胞荧光染色显示细胞可顺沟脊方向有序排列,其中50μm组细胞长轴与沟脊的延伸方向一致性最好（P＜0.05）。4.Vinculin检测发现细胞黏着斑蛋白分泌集中于沟脊部位,半定量分析显示50μm组 Vinculin 分泌最多（P＜0.05）。5.α平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）检测结果显示脊宽对成纤维细胞的成肌分化有调节作用,其中50μm组α-SMA表达最强（P＜0.05）。第二部分1.各部位骨骼直径及皮肤至骨面距离参数如下:股骨干直径:18-20mm,皮下至骨面距离16-18mm;髂骨翼垂直方向测量:髂骨翼骨内部分距离10-50mm,皮下至骨面距离20-22mm;髂骨侧方垂直测量:骨内部分25-30mm,皮下至骨面距离15-18mm;胫骨干直径12-14mm,皮下至骨面距离8-10mm。2.植入部位选择及植入物直径选择:植入螺钉比较,选择植入物直径为3.5mm,髂骨翼置钉易松动,置钉不牢固;胫骨中段外侧因腓骨遮挡,植入2根螺钉难以实现平行居中;股骨中段置钉术后,所有植入螺钉埋置皮下并近乎完全脱落,植入部位相比较选择胫骨内侧。3.根据实验结果设计内植物参数如下:长为50mm,直径3.5mm,其中骨内部分长20mm,皮下部分长15mm,皮外部分长15mm。4.经皮植入钛合金材料体内实验大动物模型建立:通过对小香猪胫骨内侧植入合适直径和长度的钛合金经皮植入物,建立大动物体内实验动物模型。第三部分1.大动物实验钛合金植入物测量参数如下:总长度为50mm,直径为3.5mm,骨外部分长为30mm,骨内带螺纹部分长20mm,螺距为1.5mm,螺纹深度为0.35mm。2.经皮部位沟槽修饰测量参数如下:沟槽长度30mm,沟槽方向与经皮植入物垂直,脊宽50μm,沟宽80μm,沟深10μm。3.植入物经皮部分涂层为Mg/Zn-MOF74杂化涂层,涂层厚度为3.6±0.8μm。4.不同改性表面的经皮植入物横切面接触角测量:光滑修饰表面（AT-p）和沟槽修饰表面（AT-g）的接触角分别为:75.16°±0.75°、71.83°±0.75°,沟槽联合MOF修饰表面（AT-g-m）及MOF修饰表面（AT-m）接触角近乎为0,MOF涂层修饰的两组表面水接触角近乎为零,与光滑表面和沟槽表面相比有显著差异（P＜0.05）;沟槽表面及光滑表面水接触角测试比较无明显统计学差异（P＞0.05）。5.术后钉道周围观察:①在置钉75天时,MOF涂层组软组织整合明显优于非MOF涂层组。MOF涂层在置钉早期对钉道周围炎症反应具有显著抑制作用,而沟槽结构无此作用。②在置钉135天时,沟槽及MOF修饰组其钉道周围炎症反应无明显差异,但均优于光滑表面组。③在置钉135天时,沟槽修饰组较75天时其外观炎症反应以及软组织整合情况明显好转。而135天的MOF修饰组在外观炎症反应以及软组织整合方面明显优于135天的光滑表面组,而与135天的沟槽修饰组无显著差异。6.术后影像学观察:①术后即刻X线拍片提示:双侧胫骨植入钛钉位置满意,穿透双侧皮质,植入平行、间隔均匀,分布对称,符合实验要求。②术后135天拍片提示:部分钉子脱落,置钉骨内部分可见局部骨痂及骨质增生,胫骨局部粗大,骨痂包裹钉道。残存钛钉可见骨内部分钉道周围无松动、感染迹象,稳定性好。7.术后脱钉情况观察:在置钉后7天内,各组实验未发现掉钉情况,7-14天之间开始出现掉钉现象,各实验组均有掉钉情况;21天至28天时掉钉达到高峰期,28天以后掉钉明显减少。统计学数据分析显示在置钉14天至28天之间,四组掉钉情况不相同,其中光滑表面组掉钉率最高,沟槽联合MOF涂层组掉钉率最低。28天以后四组掉钉情况无统计学差异。8.血清学感染指标检测:①在置钉75天时,局部有炎性反应,但随着时间延续,局部炎性反应明显改善,恢复正常;②对不同时段感染指标检测及比较,说明在植入钛钉后,没有引起严重全身感染反应。9.组织学观察:①对于不同时段上皮下移距离测量,非沟槽修饰是沟槽修饰的2.5倍。与光滑表面相比较,MOF修饰对上皮下移无抑制作用,且与植入时间阶段无相关性。光滑表面,随着植入时间的延长,上皮下移距离增大,经过沟槽和沟槽联合MOF修饰,上皮下移距离没有统计学差异（P＞0.05）。②通过HE染色观察,75天时,光滑表面组及沟槽表面组周围组织内可见大量炎症细胞,而沟槽联合MOF涂层以及MOF涂层组的炎症细胞却更少。在135天时,四组经皮植入物表面的炎症反应相比,无明显统计学差异。结论:1.钛片表面沟脊修饰可对成纤维细胞的排列、黏附和成肌分化产生影响。当脊宽50μm时,细胞排列极性更强、黏附相关蛋白分泌更多、成肌分化趋势更显著。2.胫骨中段内侧是小香猪等大动物体内经皮植入物检测的理想植入部位,钛合金经皮植入材料的参数为长50mm,骨内部分长20mm,皮下部分长15mm,皮外部分长 15mm,直径 3.5mm。3.钛合金表面的沟槽修饰可以抑制上皮细胞的下移,减少经皮部位的松动;MOF涂层可在植入早期发挥抗感染作用。表面沟槽改性和MOF涂层修饰可以显著提高的经皮植入钛合金材料的体内整合和生物密封效果,有效降低感染率和脱钉率。