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研究目的:抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)是一种非器官特异性自身免疫性疾病,血栓形成是其主要的病理基础和最突出的临床表现,也是APS首要的死因。研究表明,血清中高滴度的抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody, aPL)(尤其是抗β2GPI 抗体)在APS血栓形成起着极其关键的作用,但是具体的机制仍不清楚。本课题组前期研究发现,抗β2GPI抗体/β2GPI复合物能够通过刺激核因子 κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)和激活蛋白-1 (activator protein-1,AP-1)的活化,从而诱导单核细胞表达组织因子(tissue factor,TF)和炎症因子,但目前还缺乏足够的体内实验阐述NF-κB和AP-1在aPL/抗β2GPI抗体诱发体内血栓形成中的作用。此外,近期有研究表明,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(the mammalian target of rapamycin complex,mTORC)通路在 APS 血管壁内皮炎症激活导致血管损伤的过程中起着关键作用。因此,本论文旨在前期研究的基础上,分别利用实验性APS (EAPS)小鼠模型和单核细胞(THP-1和人外周血单核细胞)探讨NF-κB/AP-1和mTOR在抗β2GPI自身抗体诱导血栓形成中的作用及其调控的效应分子,为APS血栓形成的防治提供新思路。研究方法:(1)建立EAPS小鼠模型,BALB/c小鼠分别于0 h和48 h腹腔注射抗β2GPI抗体(500μg/只)或APS病人来源的IgG(IgG-APS)(500 μg/只),72 h后用于实验。取小鼠腹腔巨噬细胞,超声裂解,收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况,验证anti-β2GPI自身抗体是否能诱导NF-κB和AP-1的活化。(2) BALB/c 小鼠先用 NF-κB 抑制剂 PDTC(100 mg/kg/day)或/和AP-1 抑制剂姜黄素(curcumin,Cur) (50 mg/kg/day)预处理 2 h,再进行腹腔注射抗β2GPI抗体(500 μg/只),取小鼠腹腔巨噬细胞和胸主动脉,Western blotting方法检测NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化情况,观察PDTC和姜黄素对抗β2GPI抗体诱导NF-κB和AP-1活化的影响。(3)取EAPS小鼠腹腔巨噬细胞、双侧颈动脉和胸主动脉,运用RT-qPCR 和 Western blotting 方法分别检测 TF、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 和蛋白的表达,Xa生成法检测TF活性,免疫荧光检测腹腔巨噬细胞内TF、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表达,从而进一步分析NF-κB和AP-1活化对抗β2GPI抗体诱导小鼠TF和促炎细胞因子表达的影响。(4)采用抗β2GPI 抗体(10 μ/mL) /β2GPI (100 μg/mL)或 APS-IgG(250 μg/mL) /β2GPI (100 μg/mL)复合物处理 THP-1 细胞或人外周血单核细胞一段时间后,收集细胞总蛋白、RNA及上清液,运用RT-qPCR方法检测TF和IL-8的mRNA的表达,Xa生成法检测TF活性,ELISA方法检测IL-8的表达,Western blotting方法检测mTOR磷酸化的情况,观察抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI诱导单核细胞表达TF和IL-8及mTOR活化的情况。(5)先采用mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin,100 nM)预处理THP-1细胞或人外周血单核细胞20 h后,再用抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物处理一段时间后,收集细胞总蛋白、RNA及上清液,运用RT-qPCR方法检测TF和IL-8的mRNA的表达,Xa生成法检测TF活性,ELISA方法检测IL-8的表达,Western blotting 方法检测 mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65磷酸化的情况,观察雷帕霉素对抗β2GPI抗体/β2GPI 或 APS-IgG/β2GPI 诱导单核细胞 mTOR、p38、ERK1/2、JNK和NF-κB p65活化的影响。(6) THP-1 细胞先采用 p38 抑制剂(SB203580,10 μM)、ERK1/2抑制剂(U0126,5 μM)、JNK1/2抑制剂(SP600125,90 nM)、NF-κB 抑制剂 (PDTC,20μM)和 TLR4 抑制剂 (TAK-242, 5μM)预处理 2 h 后,再用抗β2GPI 抗体/32GPI 或 APS-IgG/β2GPI复合物处理一段时间后,收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测mTOR磷酸化情况,观察它们对抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导THP-1细胞mTOR活化的影响。研究结果:(1)抗β2GPI抗体和IgG-APS均能显著增加小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB p65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平,与对照组NR-IgG比较差异显著(p<0.05)。(2) PDTC和姜黄素能分别明显地减弱抗β2GPI抗体诱导小鼠NF-κBp65和c-Jun/AP-1的磷酸化水平(p<0.05),且二者没有共同的抑制效应。但发现姜黄素能明显降低抗β2GPI抗体诱导小鼠腹腔巨噬细胞NF-κBp65磷酸化水平(p<0.05),对主动脉NF-κB p65磷酸化水平也有微弱地抑制效应但没有统计学意义(p>0.05)。(3) PDTC或/和姜黄素均能显著抑制经由抗体β2GPI抗体诱导的小鼠颈动脉腹腔巨噬细胞TF活性的升高、胸主动脉TF、E-selectin、ICAM-1和VCAM-1mRNA和蛋白的表达增加、腹腔巨噬细胞TF、IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA和蛋白的表达增加(p<0.05),且PDTC显示最强的抑制效应,而二两者联合使用时没有协同效应。(4)抗β2GPI抗体/β2GPI和APS-IgG/β2GPI复合物均能显著增加THP-1细胞或人外周血单核细胞TF和IL-8的表达以及mTOR磷酸化水平(p<0.05),且对mTOR磷酸化的影响显示时间依赖性,于刺激45 min (THP-1细胞)和60 min (人外周血单核细胞)时磷酸化水平最强。(5)雷帕霉素预处理THP-1和人外周血单核细胞20h后,抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导的TF和IL-8的表达以及mTOR、p38、ERK1/2和NF-KBp65的磷酸化水平均能被明显地抑制(p<0.05),而对JNK的磷酸化水平无抑制效应(p>0.05)。(6)抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导THP-1细胞mTOR的活化能被p38抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂U0126或TLR4抑制剂TAK-24显著地抑制(p<0.05),而JNK抑制剂SP600125或NF-κB抑制剂PDTC无抑制效应(p>0.05)。结论:(1)在EAPS模型小鼠体内,NF-κB和c-Jun/AP-1参与介导抗β2GPI抗体诱导小鼠TF、粘附分子(E-selectin、ICAM-1和VCAM-1)和炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达,表明NF-κB和c-Jun/AP-1在aPL诱导的促血栓、促炎症状态中发挥着极其重要的作用。(2)体外研究发现,mTOR参与介导了抗β2GPI抗体/β2GPI或APS-IgG/β2GPI复合物诱导单核细胞TF和IL-8的表达,TLR4、p38和ERK1/2能够调节mTOR的活化,表明mTOR在APS的发病机制起到重要的作用。(3) NF-κB、c-Jun/AP-1或mTOR的抑制剂均能够降低抗β2GPI抗体诱导的促血栓和促炎症因子的表达,表明NF-κB、c-Jun/AP-1和mTOR可作为APS血栓形成防治的新靶点。