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背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种以细胞内神经炎性斑块形成(neurite plaques,NPS)、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)及神经突触和神经元脱失为主要病理改变的慢性进行性中枢神经系统变性疾病,这些病理改变主要集中在额、颞和顶叶,海马最为明显。AD以渐进性认知功能障碍和人格精神异常为主要临床表现。目前在世界范围内约有2500万人罹患AD,给患者造成严重的痛苦,给家庭和社会带来沉重的负担,已成为严重的社会公共卫生问题。但至今AD发病机制仍不完全清楚,基因突变可解释家族性AD的发病,但家族性AD仅占AD患者的1%以下,绝大部分的AD患者呈散发性。近年研究表明表观遗传修饰尤其是DNA甲基化的改变参与散发性AD的发病。特定基因启动子区甲基化程度异常及全基因组甲基化程度减低均与散发性AD的发生有着密切关系。DNA甲基化是指：S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基供体,在甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMTS)和甲基结合蛋白(Methl binding proteins,MBPs)的作用下,将甲基(-CH3)转移到DNA分子特定碱基的过程。叶酸缺乏时,一方面可以引起DNA链断裂和碱基位点脱失等DNA损伤,另一方面可以造成SAM生成减少,导致可用的甲基基团减少,由此引起一系列DNA甲基化状态的改变,对基因的表达起到调控作用。之前有关散发性阿尔茨海默病的DNA甲基化研究主要集中在DNA总体甲基化和特定基因启动子区甲基化两个方面,DNA甲基化的调控因素(如甲基转移酶等)的相关研究相对较少。本研究采用病例对照和体外实验相结合的方法,研究DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A基因表达和叶酸水平与散发AD的关系,有助于了解AD的发病机制,为治疗和预防阿尔茨海默病提供新的思路和方法。第一部分散发阿尔茨海默病患者外周血DNMT1、DNMT3A基因表达及血清叶酸水平的病例对照研究目的：探讨散发阿尔茨海默病患者与正常对照组相比外周血是否存在DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平的异常,为阿尔茨海默病的治疗、预防及生物标记研究提供新的思路。方法：1病例采集AD组：随机收集AD患者55例,均为2013年05月-2014年1月山东大学第二医院神经内科门诊和住院病人。所有AD患者均行MMSE、HIS、 HAMD、CDR量表检测,并根据临床痴呆评定量表(CDR)得分将AD病例分为轻度13例、中度12例、重度30例。入组标准：①所有患者符合美国国立神经疾病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)中“很可能的AD”诊断标准2010年修订版；②MMSE评分：文盲≤17分,小学程度<20分,中学程度≤22分,大学程度<24分;HIS<4分；HAMD＜8分；③无脑外伤,无脑出血、脑梗死、冠心病等心脑血管疾病病史；④无其他严重躯体疾病,如脑积水、硬膜下血肿、恶性肿瘤、甲状腺功能低下、感染、肝功能异常、神经梅毒、HIV感染、代谢障碍及中度等；⑤无精神疾病及痴呆家族史。正常对照组：随机收集同期性别、年龄相匹配的健康查体老年人31例,均行MMSE量表检测。入组标准：①MMSE≥27分；②无脑外伤,无脑出血、脑梗死、冠心病等心脑血管疾病病史；③无其他严重躯体疾病,如脑积水、硬膜下血肿、恶性肿瘤、甲状腺功能低下、感染、肝功能异常、神经梅毒、HIV感染、代谢障碍及中度等；④无精神疾病及痴呆家族史。2指标检测：所有入选研究对象均同时留取清晨空腹EDTA抗凝全血3m1,空腹非抗凝全血3m1,应用实时荧光定量RT-PCR技术检测DNMT1、DNMT3A基因表达,应用化学发光法检测血清叶酸水平。实验结果使用SPSS16.0进行统计分析。结果：1、独立样本t检验结果显示病例组与对照组在年龄、性别构成、受教育水平、身高、体重、BMI方面无显著差异(P>0.05),具有可比性。2、独立样本t检验结果显示与正常对照组相比,病例组外周血DNMT1、 DNMT3A基因表达显著升高(P<0.05),血清叶酸水平明显下降(P<0.000)。3、单因素方差分析显示病例组内轻、中、重度阿尔茨海默病患者外周血DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平均无显著性差异(P>0.05)。4、独立样本t检验显示病例组和对照组内不同性别阿尔茨海默病患者外周血DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平均无显著性差异(P>0.05)。5、单因素方差分析显示病例组和对照组内不同受教育程度阿尔茨海默病患者外周血DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平无显著差异(P>0.05)。6、单因素方差分析显示病例组和对照组内不同年龄阶段阿尔茨海默病患者外周血DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平无显著性差异(P>0.05)。7、Spearman秩相关分析结果显示病例组和对照组中DNMT1、DNMT3A基因表达和血清叶酸水平与年龄、受教育水平均无显著相关性(P>0.05)。8、Spearman秩相关分析结果显示病例组和对照组中叶酸水平与DNMT1、 DNMT3A基因表达均无显著相关性(P>0.05)。第二部分叶酸缺乏对SHSY5Y细胞生长的影响及与DNMT1、DNMT3A基因表达的关系目的：研究叶酸缺乏对SH-SY5Y细胞DNMT1、DNMT3A基因表达的影响,并通过细胞活性和细胞外Aβ40的检测研究叶酸缺乏对神经细胞生长的影响。材料和方法：使用不同叶酸浓度的培养基培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y), MTT法检测细胞活性,ELISA法检测细胞外Aβ40含量,实时荧光定量RT-PCR法检测细胞DNMT1、DNMT3A的基因表达。实验结果使用SPSS16.0进行统计分析。结果：1、与对照组相比,各实验组(0、8、16、32ug/ml)叶酸浓度对细胞活性均有抑制作用,细胞活性均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组各组两两比较,差异无统计学意义。2、与对照组、8、16、32ug/ml组分别两两比较,Oug/ml组细胞外Aβ40浓度明显增加,差异具有统计学意义(p<0.01)。对照组、8、16、32ug/ml组组间比较无显著性差异。3、与对照组、8、16、32ug/ml组分别两两比较,0ug/ml组细胞DNMT1、 DNMT3A的基因表达均明显增加,差异具有统计学意义(p<0.01)。结论：1、散发性阿尔茨海默病外周血存在DNMT1、DNMT3A基因表达的升高,为阿尔茨海默病生物标志物的研究提供了新的依据和方向。2、叶酸缺乏是散发性阿尔茨海默病的危险因素,可以造成神经细胞外Aβ40的累积,抑制神经细胞的存活。但补充叶酸要适度,叶酸过量也会抑制神经细胞的存活,具体剂量界定有待进一步研究。3、DNMT1、DNMT3A的基因表达升高可能是叶酸缺乏造成的结果。