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目的:
论证IL-1β在虚寒证模型中的作用,阐释虚寒证的生物学机制。IL-1β基因敲除小鼠的制备及鉴定。利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶获得敲除IL-1β基因小鼠,用于基因型鉴定的DNA来源于动物的尾巴,设计引物,进行PCR实验,使用2%的琼脂糖凝胶对PCR的产物进行电泳分离,根据凝胶电泳结果判断动物的基因型。
方法:
IL-1β基因敲除小鼠寒热表征的改变。分纯合子组(IL-1β△/△)、杂合子组(IL-1β△/+)、野生组(IL-1β+/+)。各组小鼠检测相同时间内寒热趋向、肛温、旷场实验,和血清总甲状腺素(T4)、促甲状腺素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、血清总三碘甲状腺原氨酸(T3)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、线粒体解偶联蛋白2(UCP-2)、环磷酸腺苷(cAMP)、皮质醇(CORT)、谷氨酸(Glu)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5-HT)、IL-6、IL-10、脂素亚型1(Lipin-1)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的水平。数据采用GraphPad Prism软件、SIMCA-P11.5软件分析。
IL-1β基因敲除小鼠虚寒证表征的研究。分为敲除IL-1β基因小鼠纯合子对照组(IL-1β△/△,不给药),纯合子知柏地黄丸药组(IL-1β△/△ZBDP),纯合子金匮肾气丸组(IL-1β△/△JGSP),野生对照组(+/+Control)、野生虚寒模型组(+/+DC)、野生知柏地黄丸药组(+/+ZBDP),野生金匮肾气丸组(+/+JGSP)。实验周期2个月,第一个月,+/+DC、+/+ZBDP、+/+JGSP灌胃寒性中药复方造虚寒证模型,第二个月IL-1β△/△ZBDP灌胃知柏地黄丸,IL-1β△/△JGSP灌胃金匮肾气丸,+/+ZBDP灌胃知柏地黄丸,+/+JGSP灌胃金匮肾气丸。为防止寒性中药所造虚寒证模型有自愈性,+/+DC、+/+ZBDP、+/+JGSP还同时灌胃造虚寒证模型的寒性中药复方。实验结束后检测各组小鼠的肛温、趾温、血糖水平和相同时间内在热区的时间,各组小鼠进行红外热相仪拍照后用FLIR Tools分析得到小鼠背部的平均温度,通过旷场实验获得在相同时间(6min)内小鼠的总平均运动速度、总休息时间、在旷场中央区域的总时间,通过高架十字迷宫实验获得相同时间内(5min)小鼠的总路程、总休息时间、在开放区域的总时间,通过TSE实验获得呼吸交换率(RER)、每只小鼠每小时所耗的能量(H),利用代谢笼获得摄入食物量并计算摄入能,所得数据采用GraphPad Prism、SIMCA-P11.5分析。
IL-1β基因敲除小鼠产生虚寒证RNA表达谱的改变。对+/+Control,IL-1β△/△小鼠的下丘脑和垂体进行RNA-Seq(Quantification)检测及分析。
结果:
IL-1β基因敲除小鼠经鉴定表明成功获得敲除IL-1β基因小鼠的纯合子、杂合子和野生小鼠。
IL-1β基因敲除小鼠寒热表征的改变结果显示,与IL-1β+/+组小鼠比,IL-1β△/△小鼠血清T3、T4、ATP、UCP-2、CORT、NE的水平降低(P<0.05),相同时间内在热区的时间、在旷场内总休息时间、血清5-HT、TRH水平升高(P<0.05),IL-10明显升高(P<0.01),血清TSH、cAMP、Glu、DA、IL-6、TG、TC的水平明显降低(P<0.01),肛温显著降低(P<0.001),与IL-1β△/+对比,血清ATP、UCP-2、CORT、Glu、NE、IL-6水平降低,血清T3、T4、TSH、cAMP、DA、Lipin-1、TG、TC水平降低(P<0.05),肛温明显降低(P<0.01),相同的时间在热区时间、在旷场内总休息时间和血清TRH、IL-10水平升高,血清5-HT水平升高(P<0.05。SIMCA-P11.5软件对数据分析后显示IL-1β+/+?IL-1β△/+小鼠分离,各组之间得到了明显区分,特别是IL-1β+/+和IL-1β△/△分离更明显,存在明显的区别。
IL-1β基因敲除小鼠虚寒证表征的研究结果显示,与+/+Control相比,+/+DC小鼠相同时间内在热区的时间、在高架内休息时间升高,在旷场内休息时间升高(P<0.05),趾温、十字高架内总路程、摄入能、每只小鼠每小时所消耗的能量降低,体表平均温度降低(P<0.05),呼吸交换率明显降低(P<0.01),肛温显著降低(P<0.001);与+/+Control相比,1β△/△小鼠趾温、体表平均温度、十字高架总路程、摄入能、每只小鼠每小时所消耗的能量降低,肛温降低(P<0.05),呼吸交换率明显降低(P<0.01),相同时间内在热区的时间、在旷场内休息总时间、在十字高架内休息总时间升高。SIMCA-P11.5软件对数据分析后显示+/+Control和+/+DC小鼠分离,两组之间得到了明显区分,+/+DC和IL-1β△/△两组小鼠没有明显的区分。
IL-1β基因敲除小鼠产生虚寒证RNA表达谱的改变结果显示,从小鼠垂体提取的RNA进行RNAseq分析,IL-1β△/△与+/+Control比,IL-1β△/△上调的224个DEG,IL-1β△/△下调238个DEG。对小鼠垂体提取的RNA进行KEGG途径富集分析,IL-1β△/△与+/+Control之间的所有差异基因(包括表达上调的和表达下调的)中,最主要生化代谢途径和信号转导途径为:Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Bacterial secretion system、Cytokine-cytokine receptor interaction、Quorum sensing、Protein export。
从小鼠下丘脑提取的RNA进行RNAseq分析,IL-1β△/△与+/+Control比,IL-1β△/△上调427个DEG,IL-1β△/△下调458个DEG。小鼠下丘脑提取的RNA进行KEGG Pathway富集分析,IL-1β△/△与+/+Control之间的所有差异基因(包括表达上调的和表达下调的)中,最主要生化代谢途径和信号转导途径为Steroid biosynthesis、MAPK signaling pathway Parathyroid hormone synthesis,secretion、Ras signaling pathway。
结论:
IL-1β信号通路降低是虚寒证产生的分子基础,敲除IL-1β基因小鼠符合虚寒证的生物学表达特征,可以用来作为虚寒证模型。
论证IL-1β在虚寒证模型中的作用,阐释虚寒证的生物学机制。IL-1β基因敲除小鼠的制备及鉴定。利用CRISPR/Cas9系统进行基因打靶获得敲除IL-1β基因小鼠,用于基因型鉴定的DNA来源于动物的尾巴,设计引物,进行PCR实验,使用2%的琼脂糖凝胶对PCR的产物进行电泳分离,根据凝胶电泳结果判断动物的基因型。
方法:
IL-1β基因敲除小鼠寒热表征的改变。分纯合子组(IL-1β△/△)、杂合子组(IL-1β△/+)、野生组(IL-1β+/+)。各组小鼠检测相同时间内寒热趋向、肛温、旷场实验,和血清总甲状腺素(T4)、促甲状腺素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、血清总三碘甲状腺原氨酸(T3)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、线粒体解偶联蛋白2(UCP-2)、环磷酸腺苷(cAMP)、皮质醇(CORT)、谷氨酸(Glu)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5羟色胺(5-HT)、IL-6、IL-10、脂素亚型1(Lipin-1)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的水平。数据采用GraphPad Prism软件、SIMCA-P11.5软件分析。
IL-1β基因敲除小鼠虚寒证表征的研究。分为敲除IL-1β基因小鼠纯合子对照组(IL-1β△/△,不给药),纯合子知柏地黄丸药组(IL-1β△/△ZBDP),纯合子金匮肾气丸组(IL-1β△/△JGSP),野生对照组(+/+Control)、野生虚寒模型组(+/+DC)、野生知柏地黄丸药组(+/+ZBDP),野生金匮肾气丸组(+/+JGSP)。实验周期2个月,第一个月,+/+DC、+/+ZBDP、+/+JGSP灌胃寒性中药复方造虚寒证模型,第二个月IL-1β△/△ZBDP灌胃知柏地黄丸,IL-1β△/△JGSP灌胃金匮肾气丸,+/+ZBDP灌胃知柏地黄丸,+/+JGSP灌胃金匮肾气丸。为防止寒性中药所造虚寒证模型有自愈性,+/+DC、+/+ZBDP、+/+JGSP还同时灌胃造虚寒证模型的寒性中药复方。实验结束后检测各组小鼠的肛温、趾温、血糖水平和相同时间内在热区的时间,各组小鼠进行红外热相仪拍照后用FLIR Tools分析得到小鼠背部的平均温度,通过旷场实验获得在相同时间(6min)内小鼠的总平均运动速度、总休息时间、在旷场中央区域的总时间,通过高架十字迷宫实验获得相同时间内(5min)小鼠的总路程、总休息时间、在开放区域的总时间,通过TSE实验获得呼吸交换率(RER)、每只小鼠每小时所耗的能量(H),利用代谢笼获得摄入食物量并计算摄入能,所得数据采用GraphPad Prism、SIMCA-P11.5分析。
IL-1β基因敲除小鼠产生虚寒证RNA表达谱的改变。对+/+Control,IL-1β△/△小鼠的下丘脑和垂体进行RNA-Seq(Quantification)检测及分析。
结果:
IL-1β基因敲除小鼠经鉴定表明成功获得敲除IL-1β基因小鼠的纯合子、杂合子和野生小鼠。
IL-1β基因敲除小鼠寒热表征的改变结果显示,与IL-1β+/+组小鼠比,IL-1β△/△小鼠血清T3、T4、ATP、UCP-2、CORT、NE的水平降低(P<0.05),相同时间内在热区的时间、在旷场内总休息时间、血清5-HT、TRH水平升高(P<0.05),IL-10明显升高(P<0.01),血清TSH、cAMP、Glu、DA、IL-6、TG、TC的水平明显降低(P<0.01),肛温显著降低(P<0.001),与IL-1β△/+对比,血清ATP、UCP-2、CORT、Glu、NE、IL-6水平降低,血清T3、T4、TSH、cAMP、DA、Lipin-1、TG、TC水平降低(P<0.05),肛温明显降低(P<0.01),相同的时间在热区时间、在旷场内总休息时间和血清TRH、IL-10水平升高,血清5-HT水平升高(P<0.05。SIMCA-P11.5软件对数据分析后显示IL-1β+/+?IL-1β△/+小鼠分离,各组之间得到了明显区分,特别是IL-1β+/+和IL-1β△/△分离更明显,存在明显的区别。
IL-1β基因敲除小鼠虚寒证表征的研究结果显示,与+/+Control相比,+/+DC小鼠相同时间内在热区的时间、在高架内休息时间升高,在旷场内休息时间升高(P<0.05),趾温、十字高架内总路程、摄入能、每只小鼠每小时所消耗的能量降低,体表平均温度降低(P<0.05),呼吸交换率明显降低(P<0.01),肛温显著降低(P<0.001);与+/+Control相比,1β△/△小鼠趾温、体表平均温度、十字高架总路程、摄入能、每只小鼠每小时所消耗的能量降低,肛温降低(P<0.05),呼吸交换率明显降低(P<0.01),相同时间内在热区的时间、在旷场内休息总时间、在十字高架内休息总时间升高。SIMCA-P11.5软件对数据分析后显示+/+Control和+/+DC小鼠分离,两组之间得到了明显区分,+/+DC和IL-1β△/△两组小鼠没有明显的区分。
IL-1β基因敲除小鼠产生虚寒证RNA表达谱的改变结果显示,从小鼠垂体提取的RNA进行RNAseq分析,IL-1β△/△与+/+Control比,IL-1β△/△上调的224个DEG,IL-1β△/△下调238个DEG。对小鼠垂体提取的RNA进行KEGG途径富集分析,IL-1β△/△与+/+Control之间的所有差异基因(包括表达上调的和表达下调的)中,最主要生化代谢途径和信号转导途径为:Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Bacterial secretion system、Cytokine-cytokine receptor interaction、Quorum sensing、Protein export。
从小鼠下丘脑提取的RNA进行RNAseq分析,IL-1β△/△与+/+Control比,IL-1β△/△上调427个DEG,IL-1β△/△下调458个DEG。小鼠下丘脑提取的RNA进行KEGG Pathway富集分析,IL-1β△/△与+/+Control之间的所有差异基因(包括表达上调的和表达下调的)中,最主要生化代谢途径和信号转导途径为Steroid biosynthesis、MAPK signaling pathway Parathyroid hormone synthesis,secretion、Ras signaling pathway。
结论:
IL-1β信号通路降低是虚寒证产生的分子基础,敲除IL-1β基因小鼠符合虚寒证的生物学表达特征,可以用来作为虚寒证模型。