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目的: 通过体外和在体肠上皮屏障模型，研究TNF-α/TNFR1-TRADD-FADD细胞凋亡途径介导克罗恩病(CD)肠上皮屏障损伤及其泛素化修饰酶A20的负调控作用;探讨艾灸通过调节A20表达从而对TNF-α/TNFR1-TRADD-FADD细胞凋亡途径介导CD肠上皮屏障损伤的保护效应机制。 方法: 1.采用IEC-18细胞建立体外肠上皮屏障模型，将其分成IEC-18空白组、IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组、siA20IEC-18+TNF-α诱导组4组，分别采用跨上皮电阻和荧光黄透过率检测各组肠上皮屏障通透性变化、流式细胞术观察各组肠上皮细胞凋亡、Western Blot法检测各组TNFR1、TRADD、RIP、FADD、A20表达变化，同时应用免疫荧光双标法观察各组肠上皮细胞A20与TRADD、RIP的共表达情况。 2.采用实验性CD大鼠建立在体肠上皮屏障模型，将44只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组、西药组，每组11只，除正常组外各组采用2，4，6-三硝基苯磺酸制备实验性CD大鼠模型。造模成功后即开始治疗，隔药灸组:取穴:天枢（双）、气海。药饼配方:附子、肉桂、丹参等辗粉，以黄酒调和成糊状放入药饼模具中制作成直径0.5cm、厚0.3cm药饼，再用90mg精制艾绒制作艾炷行隔药饼灸。每日1次，每次每穴灸2壮，共灸10次。西药组:美沙拉嗪肠溶片配制成灌胃液，每日2次，共灌胃10日。模型组和正常组不进行任何治疗，只作与治疗组相同固定。治疗结束后对各组大鼠进行原代结肠上皮细胞的分离、纯化与培养，应用细胞免疫组化、跨上皮电阻和荧光黄透过率检测法鉴定各组结肠上皮细胞屏障模型，再将100ng/mlTNF-α与各组进行体外37℃培养（孵育）24h，分别采用跨上皮电阻和荧光黄透过率检测各组肠上皮屏障通透性、流式细胞术观察各组肠上皮细胞凋亡、Western Blot法检测各组TNFR1、TRADD、RIP、FADD、A20表达的变化，同时应用免疫荧光双标法观察各组肠上皮细胞A20与TRADD、RIP的共表达情况。 结果: 第一部分 1.各组肠上皮屏障通透性变化:(1)与IEC-18空白组相比，IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组和siA20IEC-18+TNF-α诱导组的的跨上皮电阻值均有显著性降低（P均＜0.001）;与IEC-18+TNF-α诱导组相比，siA20IEC-18+TNF-α诱导组的跨上皮电阻值显著性降低(P＜0.001);且siA20IEC-18+TNF-α诱导组明显低于siA20IEC-18空白组(P＜0.001)。(2)与IEC-18空白组相比，IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组和siA20IEC-18+TNF-α诱导组的荧光黄透过率均有显著性增高（P均＜0.001）;与IEC-18+TNF-α诱导组相比，siA20IEC-18+TNF-α诱导组的荧光黄透过率显著性增高(P＜0.001);且siA20IEC-18+TNF-α诱导组明显高于siA20IEC-18空白组(P＜0.001)。 2.各组肠上皮细胞凋亡情况:与IEC-18空白组相比，IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组和siA20IEC-18+TNF-α诱导组的细胞凋亡率均有显著性增高（P均＜0.001）;与IEC-18+TNF-α诱导组相比，siA20IEC-18空白组、siA20IEC-18+TNF-α诱导组的细胞凋亡率也有显著性增高(P＜0.01，P＜0.001);且siA20IEC-18+TNF-α诱导组明显高于siA20IEC-18空白组(P＜0.001)。 3.各组TNF-α介导的TNFR1-TRADD-FADD细胞凋亡途径相关蛋白表达情况:(1)各组TNFR1表达量从高至低依次是IEC-18+TNF-α诱导组＞siA20IEC-18+TNF-α诱导组＞siA20IEC-18空白组＞IEC-18空白组，但各组之间无显著性差异（P均＞0.05）。(2)各组FADD表达量从高至低依次是siA20IEC-18+TNF-α诱导组＞IEC-18+TNF-α诱导组＞IEC-18空白组＞siA20IEC-18空白组，且各组之间也无显著性差异（P均＞0.05）。(3)各组TRADD表达量从高至低依次是siA20IEC-18+TNF-α诱导组＞IEC-18+TNF-α诱导组＞IEC-18空白组＞siA20IEC-18空白组;且与IEC-18空白组相比，IEC-18+TNF-α诱导组和siA20IEC-18+TNF-α诱导组的表达量均有显著性增高（P均＜0.05）;与siA20IEC-18空白组相比，IEC-18+TNF-α诱导组和siA20 IEC-18+TNF-α诱导组的表达量也有明显升高（P均＜0.05）。(4)各组RIP表达量从高至低依次是siA20IEC-18+TNF-α诱导组＞IEC-18+TNF-α诱导组＞siA20IEC-18空白组＞ IEC-18空白组;且与IEC-18空白组相比，siA20IEC-18+TNF-α诱导组的表达量有显著性增高（P＜0.05）;与siA20IEC-18空白组相比，siA20IEC-18+TNF-α诱导组的表达量也有显著性差异（P＜0.05）。(5)各组A20表达量从高至低依次是IEC-18空白组＞IEC-18+TNF-α诱导组＞ siA20IEC-18空白组＞siA20IEC-18+TNF-α诱导组;且与IEC-18空白组相比，siA20IEC-18空白组、siA20IEC-18+TNF-α诱导组的表达量均有明显降低（P均＜0.05）。 4.各组A20与TRADD、RIP的共表达情况:(1) IEC-18空白组、IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组、siA20IEC-18+TNF-α诱导组都以A20红色荧光与TRADD绿色荧光相间表达，但IEC-18空白组以A20红色荧光表达为主;siA20IEC-18TNF-α诱导组则以TRADD绿色荧光表达为主;IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组则呈现黄色（绿色与红色叠加）荧光表达，且IEC-18+TNF-α诱导组以偏A20红色荧光为主。(2) IEC-18空白组、IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组、siA20IEC-18+TNF-α诱导组都以A20绿色荧光与RIP红色荧光相间表达，但IEC-18空白组以A20绿色荧光表达为主;siA20IEC-18TNF-α诱导组则以RIP红色荧光表达为主;IEC-18+TNF-α诱导组、siA20IEC-18空白组则呈现黄色（绿色与红色叠加）荧光表达，且IEC-18+TNF-α诱导组以偏A20绿色荧光为主。 第二部分 1.各组大鼠体重比较:与正常组相比，模型组、隔药灸组、西药组的大鼠体重均有显著性降低（P均＜0.001）;与模型组相比，隔药灸组、西药组的大鼠体重均有显著性增高(P＜0.001，P＜0.05);而隔药灸组大鼠体重明显高于西药组(P＜0.001)。 2.各组大鼠结肠上皮细胞屏障通透性变化:(1)与正常组相比，正常+TNF-α诱导组、模型+TNF-α诱导组、隔药灸+TNF-α诱导组、西药+TNF-α诱导组的跨上皮电阻值均有显著性降低（P均＜0.001）;与正常+TNF-α诱导组相比，模型+TNF-α诱导组、隔药灸+TNF-α诱导组、西药+TNF-α诱导组的跨上皮电阻值均有显著性降低(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01);与模型+TNF-α组相比，隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的跨上皮电阻值均有显著性升高（P均＜0.001）;且隔药灸+TNF-α组较西药+TNF-α组有显著性升高（P＜0.05）。(2)与正常组相比，正常+TNF-α诱导组、模型+TNF-α诱导组、西药+TNF-α诱导组、隔药灸+TNF-α诱导组的荧光黄通过率均有显著性升高(P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001);与正常+TNF-α诱导组相比，模型+NF-α诱导组、西药+TNF-α诱导组、隔药灸+TNF-α诱导组的荧光黄通过率均有显著性升高(P均＜0.001);与模型+TNF-α诱导组相比，西药+TNF-α诱导组、隔药灸+TNF-α诱导组的荧光黄通过率均有显著性降低（P均＜0.001）。 3.各组大鼠结肠上皮细胞凋亡情况:与正常组相比，正常+TNF-α组、模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的肠上皮细胞凋亡率均有显著性增高（P均＜0.001）;与模型+TNF-α组相比，隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的肠上皮细胞凋亡率均有显著性降低（P均＜0.001），而这两组间无显著性差异(P＞0.05)。 4.各组大鼠结肠上皮细胞TNF-α介导的TNFR1-TRADD-FADD细胞凋亡途径相关蛋白表达情况:(1)与正常组，正常+TNF-α组和西药+TNF-α组比较，模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组的TNFR1表达量则有明显升高（P均＜0.01，P均＜0.05）。(2)与正常组、正常+TNF-α组比较，模型+TNF-α组的TRADD表达量明显升高（P均＜0.01），隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的TRADD表达量也较正常组有明显升高（P均＜0.05）;与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组和西药+TNF-α组的TRADD表达量则有明显降低（P均＜0.01）。(3)与正常组和正常+TNF-α组比较，模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组的RIP表达量均有明显升高（P均＜0.01，P均＜0.05）;与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的RIP表达量均有明显降低（P均＜0.01）;且隔药灸+TNF-α组的RIP表达量明显高于西药+TNF-α组（P＜0.05）。(4)与正常组比较，各组的FADD表达量均有明显升高（P均＜0.01）;与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的FADD表达量则有明显降低（P均＜0.01）。(5)与正常组比较，各组的A20表达量均有明显降低（正常+TNF-α组P＜0.05，其余各组P均＜0.01）;与正常+TNF-α组比较，模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组、西药+TNF-α组的A20表达量均有明显降低(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01);与模型+TNF-α组比较，隔药灸+TNF-α组，西药+TNF-α组的A20表达量则有明显升高（P均＜0.01）。 5.各组大鼠结肠上皮细胞A20与TRADD、RIP的共表达情况:(1)正常组、正常+TNF-α组、模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组和西药+TNF-α组均呈现A20红色荧光与TRADD绿色荧光相间表达，但正常组以A20红色荧光表达为主;模型+TNF-α组则以TRADD绿色荧光表达为主;隔药灸+TNF-α组与西药+TNF-α组则呈现黄色（红色与绿色叠加）荧光表达，且隔药灸+TNF-α组以偏A20红色荧光为主。(2)正常组、正常+TNF-α组、模型+TNF-α组、隔药灸+TNF-α组和西药+TNF-α组均呈现A20绿色荧光与RIP红色荧光相间表达，但正常组以A20绿色荧光表达为主;模型+TNF-α组则以RIP红色荧光表达为主;隔药灸+TNF-α组与西药+TNF-α组则呈现黄色（绿色与红色叠加）荧光表达，且隔药灸+TNF-α组以偏A20绿色荧光为主。 结论: 1.本研究结果显示，经TNF-α诱导后的体外和在体CD肠上皮屏障模型均可出现肠上皮细胞明显凋亡和肠上皮屏障通透性显著增加;同时伴有TNF-α介导的细胞凋亡途径相关蛋白TNFR1、TRADD、FADD、RIP表达增加，提示TNF-α/TNFR1-TRADD-FADD细胞凋亡途径是导致CD肠上皮屏障损伤的主要环节之一。 2.体外实验证实，经TNF-α诱导后的各组肠上皮屏障模型中，以A20基因沉默组的肠上皮细胞凋亡和肠上皮屏障通透性增加最为显著;同时伴有该细胞凋亡途径相关蛋白TRADD、RIP表达增加，说明泛素化修饰酶A20通过去泛素化TRADD、RIP重要接头分子，是负调控该细胞凋亡途径的重要作用蛋白。 3.在体实验证实，经TNF-α诱导后的各组CD肠上皮屏障模型中，以隔药灸组的肠上皮细胞凋亡和肠上皮屏障通透性降低最为显著;且同时出现A20表达增加和该细胞凋亡途径相关蛋白RIP、TNFR1表达降低，提示艾灸可能是通过促进/增加A20表达，从而负调控该细胞凋亡途径，达到保护或修复CD肠上皮屏障损伤的效应。