油棕酰基酰基载体蛋白硫酯酶(FATA)启动子互作转录因子筛选及其调控机制研究

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油棕(Elaeis guineensis Jacq.)又名油椰子,为原产于热带非洲的棕榈科多年生单子落叶草本植物,在中国南方地区普遍栽培,如海南、云南、广东等地,为中国最具特色的热带经济作品之一,也是世界上含油量最大的油料作物,单棵油棕每年产油量可以达到30-40公斤,产油量是椰子的二到三倍,花生的七至八倍,有“世界油王”之称。油棕中果皮富含大量棕榈油,其中棕榈油为1:1调和油,即脂肪酸和不饱和脂肪基本相等,酰基-ACP硫酯酶是调节脂肪酸饱和度的关键基因,油酸(C18:1)含量的提高可降低棕榈酸(C16:0)等饱和脂肪酸在总油脂中所占比例,达到食用油改良的目的,而EgFATA正是水解C18:1-ACP、决定油酸积累的关键基因。为解析EgFATA脂肪酸代谢中的调控机制,构建酵母单杂交载体,筛选出与EgFATA启动子互作的转录调节因子—EgGRP 2A,通过瞬时转染实验、沉默油棕胚性愈伤等实验,探寻转录调节因子GRP 2A与FATA之间的调控关系。取得的研究结果如下:1.获得EgproFATA目的片段,生物信息学分析发现该序列富含参与光反应、脱落酸、茉莉酸甲酯反应、细胞周期调控的功能原件。2.构建EgproFATA酵母单杂交载体,通过酵母单杂交,筛选出与EgproFATA互作的蛋白,共60个。鉴于实验室之前的研究结果,和富含甘氨酸的RNA结合蛋白GRP 2A在转录调控方面还未有报道,选择EgGRP 2A用于下一步实验。荧光定量结果显示,EgGRP 2A在油棕果实发育第4时期表达量最高,与EgFATA表达趋势相一致。3.对EgGRP 2A进行生物信息分析,结果显示EgGRP 2A为疏水性、非跨膜蛋白。利用洋葱叶片对EgGRP 2A进行定位实验,和在酵母菌株中进行转录激活活性验证,发现EgGRP 2A位于细胞核且具有转录激活活性。4.对EgGRP 2A蛋白表达并纯化,凝胶迁移EMSA实验结果,EgGRP 2A能够与EgproFATA结合。5.EgGRP 2A瞬时转染油棕原生质体,荧光定量PCR分析得,与空载相比较,过表达EgGRP 2A的油棕原生质体中EgFATA的表达量上调。6.构建沉默EgGRP 2A载体,并获得稳定沉默EgGRP 2A的油棕胚状体,荧光定量PCR检测转基因油棕胚状体EgGRP 2A和EgFATA的表达量。结果显示,与野生型相比较,EgGRP 2A在沉默胚状体的表达量均显著下降,且EgFATA的表达量随着EgGRP 2A基因下降而下降,呈正相关性。结果进一步证实了,EgGRP 2A能够上调EgFATA的表达。7.进一步研究沉默EgGRP 2A对油脂的影响,分别提取实验组和两组对照的胚状体油脂,经甲酯化后,进行GC-MS分析发现:EgGRP 2A被沉默后,与野生型和病毒空载相比,C18:0、C18:1被显著性下调,C18:1受到的影响更大。综上所述,本研究在油棕中筛选到了油酸生物释放过程的关键酶EgFATA的上游调控因子——EgGRP 2A,并阐明了转录调节因子EgGRP 2A与EgproFATA结合,并促进EgFATA的表达,上调了C18:0和C18:1,进而为研究其在后续油棕油酸的研究提供一定理论依据,为优异品种的选育和遗传改善提供分子生物学基础。
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