背景与目的药物性肝损伤（drug-induced liver injury,DILI）是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、传统中药、天然药、保健药品、药膳食膳及其代谢产物等引发的肝损伤[1]。DILI是较严重和常见的药物不良反应之一,甚至可致肝衰竭或死亡[2]。据世界卫生组织统计,DILI排名全球死亡原因的前5位[3]。据统计目前我国DILI患者在肝病患者中占比1%～5%,在急性肝炎患者中占10%;占暴发性肝衰竭患者的13%～30%[4];6%～20%的急性DILI可转变为慢性DILI,逐步发展成肝硬化,最终可导致肝衰竭[5]。传统上引发固有型DILI最典型的药物就是对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）。临床上只有一小部分易感的病人服用相关的特定药物可引发肝损伤,此为特异质型DILI的特点[6],与个体的特异质体质紧密相关。DILI发病的机制主要有:药物或者其代谢产物直接引起肝细胞应激反应引发肝细胞损伤（内在途径）;激活机体的免疫反应（外在途径）,导致线粒体膜通透性的改变、线粒体功能损伤,最终肝脏细胞坏死或凋亡[7]。根据DILI发病原因和纳差、乏力、黄疸、右胁肋部疼痛,慢性DILI可见肝脏肿大、肝掌、蜘蛛痣等这些临床表现,《中草药相关肝损伤临床诊疗指南》将其归属于胁痛、黄疸、药物毒、积聚等病证范畴[8]。黄芪是消化系统疾病最常用药物之一,现代药理学研究表明黄芪具有免疫调节、抗炎、抗损伤、抗病毒、抗凋亡、抗纤维化等多种药理活性[9]。本研究用网络药理学方法,建立黄芪成分与对乙酰氨基酚肝损伤疾病之间网络靶点,及相关信号通路分子机制,并以对乙酰氨基酚肝损伤为模型,进行体内动物实验与体外细胞实验验证,探讨黄芪提取物对实验性抗肝损伤的保护作用及其作用机制。方法1、通过网络药理数据库筛选对乙酰氨基酚肝损伤病人与正常人之间差异基因,黄芪各成分的作用靶点,再通过R语言选取两者之间共有的靶点基因。2、体外以人正常肝细胞HL-7702/L-02为研究对象,首先采用CCK8与乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）明确对乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）造模的最佳模型浓度及时间,并确定黄芪提取物的最大无毒浓度。在无毒浓度范围内进行黄芪提取物对APAP损伤的肝细胞活性及功能评价。肝细胞分为:正常组（N）,模型组（M）,黄芪提取物低剂量组（L）,黄芪提取物高剂量组（H）。LDH评价细胞损伤程度,JC-1线粒体膜电位荧光探针检测实验以及免疫荧光检测细胞色素C（cytochrome C）表达实验观察细胞线粒体损伤情况。实时荧光定量PCR检测药物孵育L-02细胞凋亡相关通路信号分子MAPK14、TRPM2、SOD1、CAT、FOS、STAT1、GADD45A、PGR、BAX、Cyt C等的m RNA表达水平。3、用对乙酰氨基酚诱导小鼠急性肝损伤,黄芪提取物干预,进行体内验证。共30只小鼠,分成正常组N（6只）、模型组M（8只）、黄芪提取物低剂量组L（8只）、黄芪提取物高剂量组H（8只）。黄芪提取物预防性给药3天后进行造模,高剂量组（H）以75 mg/kg小鼠体重灌胃、低剂量组（L）以50mg/kg小鼠体重灌胃;对乙酰氨基酚以350mg/kg小鼠体重灌胃,观察小鼠一般情况,给药12小时后处死并取材。检测小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶等肝功能生化指标,肝组织HE染色观察炎症及坏死等病理学变化。TUNEL染色检测肝组织中细胞凋亡情况。结果1、通过网络药理数据库筛选对乙酰氨基酚肝损伤病人与正常人之间差异基因,黄芪各成分的作用靶点,再通过R语言选取两者之间共有的靶点基因。通过数据库共检索到黄芪皂苷类成分16个、萜类成分2个、黄酮类成分24个,最终获得42种活性成分。皂苷类成分有25个潜在靶点,萜类成分有24个潜在靶点,黄酮类成分有257个潜在靶点。去除重复的潜在靶点基因,黄芪提取物共有278个潜在靶点。通过Gene Cards数据库共获得94条与疾病相关的人类疾病靶点基因,通过OMIM数据库获取104条与疾病相关的人类疾病靶点基因,合并数据库后共获得344个疾病相关基因。通过NCBI的GEO数据库得到健康人和患者肝脏基因共计21655个,其中在健康人和患者肝组织中表现有差异的基因为4337个,包含上调的基因1984个,下调的基因2353个。疾病与药物靶点:基于Gene Cards和OMIM数据库预测的疾病靶点与药物靶点的交集基因,通过R语言分析,获得疾病基因与药物基因的交集基因,共计11个。基于NCBI的GEO数据库获得疾病靶点基因与药物靶点的交集基因,通过R语言分析,获得疾病基因与药物基因的交集基因,共计26个。黄芪提取物有效成分作用靶点:基于Gene Cards和OMIM数据库预测的疾病-药物靶点的交集基因对黄芪提取物有效成分-作用靶点网络拓扑分析得到30个基因;基于GEO数据库预测的疾病-药物靶点的交集基因对黄芪提取物有效成分-作用靶点网络拓扑分析得到22个基因;合并后共有43个作用靶点。通过分析筛选与肝细胞凋亡相关的基因和通路,分别是:Toll样受体信号通路、凋亡、NOD样受体信号通路、p53信号通路、过氧化物酶体、MAPK信号通路、长寿调节途径、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、松弛素信号通路、雌激素信号通路、坏死、细胞衰老。共得到10个与凋亡相关的靶点基因,分别为:BAX、MAPK14、TRPM2、SOD1、CAT、FOS、STAT1、GADD45a、PGR、ND6。2、黄芪提取物对肝细胞毒性检测,空白对照组肝细胞上清LDH活性为1619.05±89.09 U/L;62.5-500μg/m L不同浓度黄芪提取物孵育,随着黄芪提取物浓度增加,肝细胞上清LDH活性先降低再升高,375μg/m L黄芪提取物孵育肝细胞12h,细胞上清LDH活性明显升高至2190.48±33.67 U/L,提示375μg/m L黄芪提取物对肝细胞有一定毒性;500μg/m L组为细胞上清LDH达到3595.24±89.09 U/L,为空白对照组的2.2倍。黄芪提取物无毒范围为0-300μg/m L。3、L-02细胞体外实验研究模型条件,CCK8法检测显示:10m M APAP孵育肝细胞12h、24h,肝细胞活力分别为80%±0.04、52%±0.08;20m M APAP孵育肝细胞3h、6h、12h、24h,细胞活力分别为109%±0.08、116%±0.02、41%±0.03、18%±0.05。提示10m M APAP孵育肝细胞24h与20m M APAP孵育肝细胞12h,均呈现明显的肝细胞毒性,后续模型选择20m M APAP孵育肝细胞12h。4、黄芪提取物对APAP诱导肝细胞的保护作用:肝细胞上清LDH活性检测显示,与空白对照组相比,20m M APAP孵育肝细胞12h明显诱导肝细胞损伤,细胞上清LDH活性为2459.46±81.08 U/L,为正常组的4.8倍;不同浓度黄芪提取物显著降低肝细胞上清LDH活性,其中低剂量组（L）LDH为891.89±27.03 U/L,高剂量组（H）LDH为1162.16±81.08 U/L,无明显剂量依赖性。5、黄芪提取物对APAP诱导肝细胞线粒体膜电位的影响:JC-1荧光探针法显示,正常肝细胞线粒体膜电位正常,以红色荧光为主;APAP诱导肝细胞损伤,线粒体膜电位明显下降,呈现绿色荧光为主;与APAP模型组比较,不同剂量黄芪提取物干预组绿色荧光明显减少、红色荧光明显增多,并且以高剂量组效果更为明显。6、黄芪提取物对APAP诱导肝细胞凋亡的影响:细胞色素C免疫荧光染色显示,与正常组相比,模型组线粒体细胞色素C表达位置与细胞核脱离,表明肝细胞凋亡;不同剂量黄芪提取物线粒体与细胞核位置基本吻合,其中高剂量组效果更为明显。7、黄芪提取物对APAP诱导肝细胞凋亡相关信号分子的影响:与正常组比较,模型组促凋亡相关基因TRPM2、SOD1、FOS、STAT1、GADD45a表达水平增高,黄芪提取物不同程度表达下降;凋亡相关基因MAPK14、CAT模型组表达有明显增高,黄芪提取物高剂量组明显降低,低剂量组MAPK14、CAT表达水平无明显变化。8、黄芪提取物对APAP急性肝损伤小鼠血清肝功能的影响:与正常组小鼠比较,模型组小鼠血清ALT、AST活性明显升高,分别为正常组的27.6倍、5倍;不同剂量黄芪提取物明显降低模型组ALT、AST水平,且高剂量组效果更好。9、黄芪提取物对APAP急性肝损伤小鼠肝组织炎症的影响:HE染色结果显示,正常组肝细胞索排列整齐规律,肝小叶结构完整,肝内细胞形态结构完整;模型小鼠肝小叶结构排列紊乱,窦周扩张、充血明显,小叶内点灶状坏死及局部炎症明显,腺泡3区或全腺泡出现大块或亚大块融合性坏死,汇管区及界面炎症不明显。不同剂量黄芪提取物组肝细胞坏死程度明显减轻,Ishak评分显示,模型组7.17±1.34,黄芪提取物低剂量组3.86±1.64,黄芪提取物高剂量组3±3.06。10、黄芪提取物对APAP急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响:TUNEL染色显示:正常小鼠肝组织无或偶见肝细胞凋亡。APAP造模12 h后,模型小鼠肝组织凋亡肝细胞数量明显增多,主要分布在病变严重的腺泡3区周围区域;与模型组相比,不同剂量黄芪提取物组肝细胞凋亡数量均显著减少,以高剂量组黄芪提取物效应更为明显。结论1.网络药理学筛选出对乙酰氨基酚（APAP）导致急性肝损伤病人肝组织与正常人肝组织之间差异基因,同时筛选黄芪各成分作用靶基因,取APAP肝损伤病理机制与黄芪药理靶基因的交集,得43个交集基因。2.初步获得13条相关富集通路,发现黄芪提取物抗药物性肝损伤可能与Toll样受体信号通路、凋亡、NOD样受体信号通路、p53信号通路、过氧化物酶体、MAPK信号通路、长寿调节途径、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路、松弛素信号通路、雌激素信号通路、坏死、细胞衰老有关。3.体内、外实验证实黄芪提取物有抗APAP急性肝损伤作用,其机制与调节凋亡相关基因MAPK14、TRPM2、SOD1、FOS、CAT、STAT1、GADD45a等的表达,抑制肝细胞凋亡相关。