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目的:明确灵猫方治疗慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)的优势环节;探讨灵猫方通过改善Bcl-6/Blimp-1表达的平衡促进Tfh细胞的分化及其对B细胞亚群分化的调节治疗CHB的免疫机制。方法:1.灵猫方治疗CHB的临床疗效:(1)开展历史前瞻性队列研究,纳入2016年6月-2019年6月在上海中医药大学附属曙光医院肝病科接受聚乙二醇干扰素α治疗的CHB患者285例。(2)分组:治疗组(T组)为聚乙二醇干扰素α联合灵猫方治疗的患者,根据病史进一步分为初治组(T1组,37例)和经治组(T2组,99例);对照组(C组)为单一使用聚乙二醇干扰素α治疗的患者,根据病史进一步分为初治组(C1组,40例)和经治组(C2组,109例),观察周期均为6个月。(3)采集各组患者治疗前后HB sAg、HB sAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBVDNA、ALT、AST和中医证候的信息。2.灵猫方对CHB患者外周血Tfh细胞(CXCR5+CD4+T细胞)、B细胞亚群分化的调节作用:(1)采集29例C2组和22例T2组患者治疗前后的血液标本,检测 ALT、AST、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、HBVDNA 的表达水平。(2)分离两组患者的血清及外周血单个核细胞(PBMCs),应用ELISA法检测患者血清中IL-21的水平;流式细胞术检测Tfh细胞频数及其表达的IL-21、Bcl-6、Blimp-1的水平和B细胞亚群的频数及IL-21R的表达水平。3.10%灵猫方药物血清通过调节Tfh细胞(CXCR5+CD4+细胞)和B细胞(CXCR5+CD19+细胞)的频数抑制HBV蛋白表达的机制:(1)分离及鉴定人外周血CXCR5+细胞:分离健康人外周血PBMCs,磁珠分选得到CXCR5+细胞,流式细胞术鉴定其纯度。(2)体外建立CXCR5+细胞和HepG2.2.15细胞的共培养体系。(3)灵猫方药物血清的制备:10只雄性SD大鼠随机分为正常组、中药高剂量组,适应性喂养1周后按照10ml/kg体重开始给予灵猫方灌胃,2次/天,连续3天,在第4天早上灌胃1h后,麻醉状态下腹主动脉取血,离心得到血清,56℃灭活30min,0.22um过滤器过滤备用。(4)10%灵猫方药物血清对共培养体系中Tfh细胞和B细胞表达的影响:将CXCR5+细胞与HepG2.2.15细胞共培养,同时加入10%的灵猫方药物血清进行干预,不同时间后收集悬浮细胞和培养上清,ELISA法检测上清中HB sAg、HBeAg的表达水平,流式细胞术检测CXCR5+细胞中Tfh细胞和B细胞的频数。结果:1.灵猫方治疗CHB临床疗效的优势环节:(1)灵猫方对CHB患者中医证候的影响:与C1组相比,T1组患者中医证候积分治疗后显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);与C2组相比,T2组患者治疗后中医证候积分显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)灵猫方对CHB患者ALT和AST复常率的影响:与C1组相比,T1组患者ALT和AST的复常率均升高,差异无统计学意义(P>0.05);与C2组相比,T2组患者ALT和AST的复常率均增加,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)灵猫方治疗HBeAg阳性CHB患者临床疗效的优势:与C1组HBeAg阴性的患者相比,HBeAg阳性患者HBsAg下降≥50%的比率明显增加,差异有统计学意义(P、<0.05);与C2组HBeAg阴性的患者相比,HBeAg阳性患者HBsAg下降≥50%的比率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与HBeAg阳性的C1组患者相比,T1组患者的HBV DNA转阴率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)灵猫方治疗HBeAg阴性CHB患者临床疗效的优势:与HBeAg阴性的C1组患者相比,T1组患者HBsAg下降≥50%的比率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);与HBeAg阴性C2组相比,C1组患者HBV DNA转阴率显著增加,差异有统计学意义(P、<0.05);与HBeAg阴性C2组相比,T2组患者HBV DNA转阴率显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.灵猫方对CHB患者Tfh细胞、B细胞亚群分化的调节作用:(1)与对照组相比,治疗组患者HBsAg下降≥1lgIU/ml的比例明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)灵猫方对Tfh细胞频数及其相关因子表达水平的影响:与治疗前相比,两组患者治疗后Tfh细胞频数增加,IL-21、Bcl-6、Blimp-1的表达下降,差异无统计学意义(P>0.05)。(3)HBsAg表达水平的下降与Tfh细胞频数及其相关因子的相关性研究:HBsAg下降≥1lgIU/ml的患者中,对照组IL-21、Bcl-6的表达减少,Blimp-1的表达增加,Tfh细胞频数无变化,而治疗组患者Tfh细胞频数及IL-21、Bcl-6的表达增多,Blimp-1的表达降低;与治疗前相比,HBsAg下降≥1lg IU/ml的患者治疗后血清中IL-21水平有增加的趋势。(4)B细胞亚群的鉴定:根据IgD、CD38抗原表达水平,B细胞分为Bml细胞(IgD+CD38-)、Bm2 细胞(IgD+CD38+)、Bm2’+Bm3Bm4 细胞(IgD+CD38++)、Bm3+Bm4 细胞(IgD-CD3 8++)、早期 Bm5 细胞(IgD-CD38+)、Bm5 细胞(IgD-CD38-)。(5)灵猫方对B细胞亚群表达的影响:与治疗前相比,对照组患者外周血Bm5细胞频数在治疗后显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与治疗前相比,治疗组患者外周血Bm2细胞频数在治疗后显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)HBsAg表达水平的下降与B细胞亚群频数及其表达的IL-21R水平的相关性研究:HBsAg 下降≥1lg IU/ml的患者中,治疗后对照组Bm2细胞、Bm3+Bm4细胞、早期Bm5细胞、Bm5细胞频数增加,Bm1细胞、Bm2+Bm3Bm4细胞频数减少;治疗组Bm1细胞、Bm2细胞的频数增加,Bm2’+Bm3Bm4细胞、Bm3+Bm4细胞、早期Bm5细胞、Bm5细胞的频数减少;HBsAg下降≥1lg IU/ml的患者中,与治疗前相比,治疗后对照组B细胞表达的IL-21R水平下降,而治疗组B细胞表达的IL-21R水平增加,差异无统计学意义(P>0.05)。3.10%灵猫方药物血清通过调节Tfh细胞和B细胞的频数抑制HBV蛋白表达的机制:(1)流式细胞术鉴定结果显示,磁珠分选的CXCR5+细胞的纯度为99.2%。(2)灵猫方药物血清对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达的调节作用:灵猫方药物血清干预HepG2.2.15细胞12h后,其上清中HBsAg、HBeAg的表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);(3)灵猫方药物血清对CXCR5+细胞和HepG2.2.15细胞共培养体系HBsAg、HBeAg表达的调节作用:灵猫方药物血清干预共培养体系48h后,上清中HBsAg和HBeAg的表达水平均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)灵猫方药物血清对共培养体系Tfh细胞和B细胞的调节作用:灵猫方药物血清干预共培养体系12h、24h后,Tfh细胞的频数明显上调,差异有统计学意义(P<0.05);灵猫方药物血清干预共培养体系24h、36h后,B细胞的频数显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.灵猫方联合聚乙二醇干扰素α可改善CHB患者中医症状,提高HBeAg阳性初治患者HBV DNA的转阴率,促进HBeAg阴性初治的患者HBsAg表达水平的下降。2.灵猫方促进CHB患者HBsAg水平降低的临床疗效可能与改善Bcl-6/Blimp-1表达的平衡促进Tfh细胞的分化及促进B细胞表达的IL-21R有关。3.灵猫方药物血清可降低CXCR5+细胞与HepG2.2.15细胞共培养体系的HBsAg和HBeAg的表达水平,其机制可能与上调Tfh细胞的频数,降低B细胞的频数有关。