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心肌肥大是肉鸡腹水综合征(Ascites Syndrome,AS)发病的中心环节。生产型肉鸡有短期内高速生长的特点,它们的心肺功能无法满足机体对氧气的需求,因此,心肌为了适应急慢性血流动力学的超负荷状态及满足机体的供氧需要,就容易出现病理性心肌肥大。心肌肥大发病过程会有大量活性氧的产生,活性氧的增加会导致心肌细胞氧化应激及细胞内线粒体功能紊乱,而清除活性氧、保护线粒体可以有效防止心肌肥大。硒(Se)是生物体不可或缺的微量元素,它以硒代半胱氨酸的形式存在于家禽至少24种硒蛋白和酶中。相比于无机硒和有机硒,纳米硒作为一种新型硒源具有高生物活性、生物利用率、低毒性、高颗粒分散性和高比表面积的特性,是一种很有前途的材料。通过比较六株益生菌对不同浓度亚硒酸钠的还原能力,本研究挑选出了1株来自牦牛源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YC-3用于制备生物源纳米硒YC-3-SeNPs,并测定出其还原亚硒酸钠的最适浓度(20 mmol/L)和时间(4 d);本研究还以壳聚糖作为保护剂和分散剂以Vc为还原剂制备了化学源纳米硒CST-SeNPs。最终,本研究制备出了YC-3-SeNPs冻干粉、胶体及CST-SeNPs胶体,并对它们进行了一系列表征。化学源纳米硒CST-Se NP和生物源纳米硒YC-3-SeNPs表征结果如下:CST-SeNPs和YC-3-SeNPs均为球形纳米硒颗粒,均在191 nm处有明显紫外吸收峰;CST-SeNPs的zeta电势为+60.5 m V,YC-3-SeNPs的ζ电势为-51.6 m V,两种胶体都具有较好稳定性;CST-SeNPs的平均粒径为126.7 nm,YC-3-SeNPs的平均粒径为112.1 nm;EDS结果显示YC-3-SeNPs外周物质中除了有Se元素(45.45%)外,还包裹有C元素(34.48%)、N元素(5.76%)和O元素(10.73%),FTIR测定结果显示,YC-3-SeNPs表面包裹着多糖、蛋白质和脂类物质。细胞试验部分,选择15日龄白羽肉鸡鸡胚提取其心室肌制备肉鸡原代心肌细胞并进行细胞鉴定。在不同浓度的Ang II(2.5×10-2,2.5×10-4,2.5×10-6,2.5×10-8,2.5×10-10 mmol/L)中选出最适合建立肉鸡心肌细胞肥大模型的浓度,然后将心肌细胞分为Control组、Ang II组(2.5×10-4 mmol/L Ang II)、CST-SeNPs+Ang II组(3.6μmol/L CST-SeNPs+2.5×10-4 mmol/L Ang II)、YC-3-SeNPs+Ang II组(3.6μmol/L YC-3-SeNPs+2.5×10-4 mmol/L Ang II)、CST-Se NP组(3.6μmol/L CST-SeNPs)和YC-3-SeNPs组(3.6μmol/L YC-3-SeNPs)。Ang II组采用Ang II处理心肌细胞48 h,CST-SeNPs+Ang II组和YC-3-SeNPs+Ang II组细胞先用纳米硒分别预处理细胞24 h,再采用Ang II处理细胞48 h,而CST-Se NP组和YC-3-SeNPs组仅采用纳米硒处理细胞24 h。细胞试验部分,确定了2.5×10-4 mmol/L的Ang II为建立肉鸡心肌细胞肥大模型的最适浓度。CCK-8试验确定了CST-SeNPs用于肉鸡原代心肌细胞的安全浓度范围为0~120μmol/L,而YC-3-SeNPs的浓度从0μmol/L增加至1200μmol/L,肉鸡心肌细胞的活性一直未受到显著影响。根据心肌细胞表面积、胚胎基因(ANP、myh7、myh6)激活情况、细胞ROS含量、线粒体膜电位及线粒体超微结构等结果,确定了CST-SeNPs和YC-3-SeNPs均可以防止Ang II诱导的肉鸡心肌肥大。Ang II可以激活胚胎基因,增加心肌细胞表面积,增加细胞ROS含量,降低线粒体膜电位,并对线粒体的结构造成损伤,而CST-SeNPs(除了myh6的基因表达量)和YC-3-SeNPs可显著抑制胚胎基因的激活,减少心肌细胞表面积,降低细胞ROS含量,恢复线粒体膜电位,且对线粒体的结构具有保护作用。与此同时,荧光定量PCR和免疫印迹结果显示,Ang II显著抑制了Nrf2、GPX1、GPX4和Trx R1的基因和蛋白表达(p<0.05),提高了Keap1基因和蛋白的表达(p<0.01);YC-3-SeNPs预处理细胞后,显著提升了Nrf2、GPX1、GPX4和Trx R1基因和蛋白的表达(p<0.05),显著降低了Keap1基因和蛋白的表达(p<0.01);而CST-SeNPs预处理细胞后,GPX4和Trx R1的基因表达没有得到显著提高,其余结果与YC-3-SeNPs预处理细胞后一致。然而,CK2作为Nrf2激活的关键调控因子,其基因和蛋白表达却没有出现和Nrf2相同的趋势变化。经过对CK2的PVDF膜进行羰基化检测发现,CK2α的表达量虽无变化,但Ang II使CK2α的羰基化程度显著提高(p<0.01),而CST-SeNPs和YC-3-SeNPs的预处理可以让CK2α的羰基化程度显著减轻(p<0.01)。免疫荧光结果显示,CK2蛋白表达量及其羰基化程度的结果与免疫印迹结果一致,且Ang II显著抑制了细胞Nrf2的表达(p<0.01),且导致Nrf2入核减少;而CST-SeNPs和YC-3-SeNPs预处理细胞后,细胞Nrf2总表达量较Ang II组显著增多(p<0.05),Nrf2入核也明显增多。动物试验部分,将60羽白羽肉鸡适应性饲养7 d后,随机分为5组(n=12):空白对照组(Control)、Ang II高剂量组(1 mg/kg/d Ang II,H-Ang II)、Ang II低剂量组(0.5 mg/kg/d Ang II,L-Ang II),Ang II高剂量+纳米硒组(1 mg/kg/d Ang II+1 mg/kg/d SeNPs,H-Ang II+SeNPs),Ang II低剂量+纳米硒组(0.5 mg/kg/d Ang II+1 mg/kg/d SeNPs,L-Ang II+SeNPs)。Ang II组每日肌注相应剂量Ang II,纳米硒组每日饲喂相应剂量的纳米硒冻干粉,共计饲养28 d,于第29天进行称重,处死后取血液和心脏。动物试验部分,根据心脏质量指数(HMI)、H.E和Masson染色、胚胎基因(ANP、myh7、myh6)激活情况等结果,发现H-Ang II组肉鸡HMI显著提高(p<0.01),心肌纤维横截面积明显增宽、心肌纤维化程度明显加深,胚胎基因显著激活(p<0.05),说明连续注射28 d 1 mg/kg/d的Ang II可以成功建立肉鸡心肌肥大模型,而L-Ang II组的肉鸡没有出现明显心肌肥大特征。H-Ang II组肉鸡的血清GSH-PX、T-AOC、CAT、SOD较Control组显著降低(p<0.01),MDA含量显著增加(p<0.01)。额外饲喂纳米硒之后,H-Ang II+SeNPs组肉鸡HMI显著降低(p<0.05),心肌纤维横截面积减小,心肌纤维化程度明显减轻,胚胎基因激活情况显著恢复(p<0.05),且各血清抗氧化指标均得到显著恢复。与此同时,荧光定量PCR和免疫印迹结果显示,Ang II显著抑制了Nrf2、GPX1、GPX4和Trx R1的基因和蛋白表达(p<0.01),增加了Keap1的基因和蛋白表达量(p<0.01),额外补充纳米硒后,Nrf2、GPX1、GPX4和Trx R1的基因和蛋白表达得到了显著提高(p<0.01),而Keap1的基因和蛋白表达显著降低(p<0.01)。CK2基因和蛋白的情况与细胞试验一致,Ang II使CK2α蛋白羰基化水平显著提高(p<0.01),且H-Ang II组显著高于L-Ang II组(p<0.01)。而额外饲喂纳米硒后,H-Ang II+SeNPs组和L-Ang II+SeNPs组的CK2α羰基化程度均较相应Ang II组显著降低(p<0.01)。本研究成功制备出YC-3-SeNPs和CST-SeNPs两种纳米硒,并对其成功表征。采用Ang II成功建立了肉鸡心肌体内和体外的肥大模型,并发现纳米硒可以通过防止心肌细胞纤维化,防止心肌胚胎基因激活,提高血清抗氧化能力,提高硒蛋白GPX1、GPX4和Trx R1的表达,防止CK2蛋白羰基化,激活Nrf2/Keap1信号通路的方式防止肉鸡心肌肥大,在细胞层面,纳米硒还可以通过清除细胞ROS,保护线粒体结构和功能的完整性来防止心肌细胞肥大。本研究为防治肉鸡心肌肥大提供了一种新的策略,也为纳米硒的应用提供了新的方向。