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第一部分 三阴性乳腺癌组织中AQP3和AQP5的表达情况目的:检测水通道蛋白3(aquaporin 3,AQP3)和水通道蛋白5(aquaporin 5,AQP5)在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)组织及癌旁正常组织中mRNA和蛋白水平的表达情况,探讨其在TNBC发生过程中的可能作用。方法:在知情同意的原则下获取泰州市人民医院甲乳外科2011年至2012年期间TNBC患者手术切除的组织标本32例,通过荧光定量PCR(Realtime PCR,RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)的方法分别检测TNBC组织和癌旁正常组织中AQP3及AQP5的表达情况。结果:1、荧光定量PCR结果显示,AQP3在TNBC组织中mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.01);AQP5在TNBC组织中mRNA表达水平也显著高于癌旁正常组织(P<0.01)。2、Western-blot结果显示,与癌旁正常组织比较,AQP3在TNBC组织中蛋白表达水平明显升高(P<0.01);另外,相较于癌旁正常组织AQP5在TNBC组织中蛋白表达水平也明显升高(P<0.01)。结论:AQP3和AQP5在TNBC组织中的表达量显著高于癌旁正常组织,由此我们推断AQP3和AQP5的表达升高可能与TNBC的发生发展有关。第二部分 三阴性乳腺癌组织中AQP3和AQP5表达分布及其与患者预后关系的研究目的:检测AQP3和AQP5在TNBC组织及癌旁正常组织中表达与分布情况,分析AQP3和AQP5表达水平与患者临床病理特征间的关系,探讨其在TNBC发生过程中的临床意义。方法:1、通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测AQP3和AQP5在TNBC组织及癌旁正常组织中的表达与分布情况。2、观察TNBC组织中AQP3和AQP5的表达水平与患者临床病理特征的相关性。3、应用Kaplan-Meier生存函数分析TNBC中AQP3和AQP5的表达水平与患者5年无复发生存期(disease-free survival,DFS)及总生存期(overall survival,OS)的影响。结果:1、在TNBC组织中AQP3和AQP5主要表达在肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆中,阳性细胞被染色呈棕黄色或棕黑色。2、在TNBC组织中AQP3和AQP5表达量比癌旁正常组织明显增高(P<0.01);特别是在肿瘤组织的浸润部位AQP5表达增高尤为明显,而在靠近中央坏死区域的部位AQP5表达则显著降低。3、TNBC组织中AQP3和AQP5的表达增高与肿瘤大小、淋巴结转移状态和远处转移情况密切相关(P<0.05),而与患者年龄、停经状态、外科手术方式、病理分级无关(P>0.05);在Ki-67高表达组患者中,AQP5的表达量比低表达组患者明显增高(P<0.05),且Spearman等级相关检验结果提示AQP5的表达量与Ki-67呈正相关(r=0.255,P<0.05);而在Ki-67高表达组与低表达组患者中AQP3的表达差异无统计学意义(P>0.05)。4、TNBC患者中,AQP5高表达组患者的5年DFS及OS比低表达组患者明显缩短(P<0.05);在四组TNBC患者中,AQP3高/AQP5高表达组患者DFS和OS缩短最为明显(P<0.05)。5、Cox生存回归模型分析提示临床病理因素中淋巴结转移状态、有无远处转移及AQP3/AQP5联合高表达是TNBC患者DFS和OS的独立危险因素。结论:1、我们首次报告了AQP3和AQP5在TNBC组织中的表达及分布情况,发现AQP3和AQP5的表达水平与患者临床病理特征有显著的相关性。2、在各组TNBC患者中,发现AQP3/AQP5联合高表达组有最短的5年无复发生存期及总生存期。3、AQP3/AQP5联合表达是TNBC患者的独立危险因素,AQP3和AQP5的检测可作为评估TNBC患者预后的理想指标,提示其可能成为TNBC新的行之有效的治疗靶点。第三部分 AQP5通过wnt/β-catenin途径调控三阴性乳腺癌细胞的增殖凋亡、侵袭迁移目的:探讨AQP5与在三阴性乳腺癌发生、发展过程中的作用机制,寻找潜在的行之有效的治疗靶点。方法:1、采用siRNA-AQP5和AQP5过表达载体转染到三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞中,成功建立AQP5差异表达的系统;2、采用CCK8(cell counting kit-8)方法研究AQP5的差异表达对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响;3、流式细胞仪检测AQP5的差异表达对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响;4、采用划痕实验(wound healing assay)方法研究AQP5在三阴性乳腺癌细胞迁移过程中的作用;5、采用细胞侵袭实验(transwell)方法研究AQP5在三阴性乳腺癌细胞侵袭过程中的作用;6、采用荧光定量PCR和Western blot方法研究,AQP5表达变化后对上皮细胞-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关分子的表达影响;7、研究 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001对AQP5过表达细胞的侵袭迁移以及下游分子的影响。结果:1、AQP5在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达水平显著高于人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A。2、上调AQP5的表达能促进三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力、抑制细胞的凋亡;AQP5基因敲降后MDA-MB-231细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞凋亡率显著上升,细胞中的Bcl-2表达降低、Caspase-3表达升高,同时细胞的迁移和侵袭能力显著减弱。3、AQP5过表达导致上皮细胞-间质转化相关分子发生显著变化,促使三阴性乳腺癌细胞更易于迁移和侵袭。4、AQP5过表达能够上调细胞核内β-catenin的表达量,并且能够增加Wnt/β-catenin信号通路下游基因的表达水平;Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001能够降低AQP5过表达对细胞的影响,进一步证实了 AQP5是通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结论:在三阴性乳腺癌细胞中,AQP5是通过激活Wnt/β-catenin信号通路导致EMT相关分子发生显著改变,增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力,抑制细胞的凋亡。