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小菜蛾,Plutella xylostella（L.）属鳞翅目菜蛾科,是十字花科蔬菜的世界性重要害虫之一。我国的甘蓝和花椰菜等十字花科作物的种植面积位居世界首位,为小菜蛾提供了充足的食物来源。但长期对于化学农药防治的依赖,使得小菜蛾成为抗药性发展最为严重的害虫之一,急需新的防治手段。“反向化学生态”是新兴的绿色控害方法,即通过阐明昆虫嗅觉分子机制,解析重要的嗅觉基因的功能,再依据其来设计成本低并且高效的害虫行为干扰剂和阻断剂。触角是昆虫的主要的嗅觉感受器官,在感知性信息素和寄主植物挥发物等嗅觉方面发挥重要作用。昆虫对气味的感受和识别类的基因已被广泛研究,但是对气味信号终止的分子机制研究较少。前期实验证明,触角中气味降解酶（odorant degrading enzyme,ODE）可以快速降解气味分子,是重要的气味信号灭活基因,而性信息素降解酶（pheromone degrading enzyme,PDE）是特化的气味降解酶,能够降解昆虫性信息素气味分子。其中,羧酸酯酶（carboxylesterase,CCE）和醛氧化酶（aldehyde oxidase,AOX）家族中的一些成员是两类重要的ODE基因,分别降解酯类和醛类气味分子。小菜蛾中同时存在酯类和醛类性信息素组分,暗示具有降解对应性信息素组分的CCE和AOX基因。雄性小菜蛾通过触角感受识别同种雌性释放的性信息素（顺11-十六碳乙酸酯（Z11-16:OAc）和顺11-十六碳烯醛（Z11-16:Ald））,搜索配偶。本论文对课题组前期鉴定的小菜蛾触角高表达的醛氧化酶（PxylAOX3）,羧酸酯酶（PxylCCE16a和PxylCCE16c）两类候选ODE基因进行了功能研究。首先通过Sf9昆虫细胞异源表达结合Ni2+亲和纯化,获得了具有酶活性的高纯度重组蛋白。进一步的酶活性测试表明,重组蛋白PxylCCE016c能够降解小菜蛾两个酯类性信息素组分Z11-16:OAc和Z9-14:OAc为对应的醇类,相对降解率分别为27.64±0.79%和24.40±3.07%。而PxylCCE016a对两个性信息素组分Z11-16:OAc和Z9-14:OAc的降解活性相对较低,相对降解率分别仅有8.40±0.27%,6.87±0.60%。同时,这两个CCE对植物来源的酯类挥发物也展现出了类似的活性差异,PxylCCE016a对Z3-6:OAc的相对降解率只有14.83±0.76%,而PxylCCE016c对Z3-6:OAc的相对降解率可以达到63.51±2.30%。此外,抑制剂实验表明,只有PxylCCE016c可以被一种常见的酯酶抑制剂磷酸三苯酯（triphenyl phosphate,TPP）抑制,其半抑制浓度(LC50)为1570±520μmol L-1。醛氧化酶PxylAOX3是触角中3个AOX基因中表达量最高的基因,暗示其是主要的醛气味降解酶。在本研究中,通过进一步昆虫细胞表达、亲和纯化和体外分析了重组PxylAOX3的酶功能:发现PxylAOX3的酶谱较宽,不仅能够降解小菜蛾性信息素的主要成分Z11-16:Ald和性信息素类似物Z11-14:Ald、Z9-16:Ald、Z10-16:Ald,相对降解率均超过40%,还能氧化降解植物来源的醛挥发物和带醛基的异生物质（丙烯醛,杀虫剂涕灭威）。此外,PxylAOX3在不同温度下对苯甲醛的酶活性分析表明,PxylAOX3的热稳定性随温度的升高逐渐降低:在20–40℃时相对稳定,在50℃时相对活性为83.62±2.44%略有下降,而在50–70℃时活性会急剧下降,60℃和70℃时分别只有64.20±2.50%和23.28±1.56%。PxylAOX3氧化活性在70–90℃范围内持续轻度下降,相对活性分别为12.34±2.07%和4.51±0.91%。此外,PxylAOX3、PxylCCE16a和PxylCCE16c的活性强弱均具有pH依赖性。PxylAOX3的酶活性在pH为5–8之间的活性不同:pH=8.0时PxylAOX3的对苯甲醛的酶活性最高;pH=7.0和pH=7.5时活性较高,约为pH=8.0时活性的80%;pH=6.0时,活性较低为22.47±2.48%;pH=5.0时,没有检测到明显活性。PxylCCE016a和Pxy CCE016c酶活性随pH从5.0到7.0时均呈上升趋势,例如:在pH=5.0时,PxylCCE016a对性信息素组分Z11-16:OAc和植物挥发物Z3-6:OAc的降解活性分别只有约5.0%、0.4%,Pxy CCE016c对这两种底物的降解活性分别也是只有约7.0%、3.0%;在pH=6.5时,PxylCCE016a对这两种底物的活性分别为7.0%、2.0%,Pxy CCE016c对这两种底物的活性分别为9.0%、19%。最后,通过同源建模和底物分子对接预测了PxylAOX3,PxylCCE016a和PxylCCE016c的三维结构以及潜在的活性结合位点和氨基酸残基,这将有助于进一步设计农药或抑制剂。两种酯酶表现出相似的α-螺旋和β-环高度匹配的3D结构,并具有相同的酶活性中心（GESAG）基序和催化三联体（Ser186-Glu320-His442和Ser186-Glu321-His444）,他们主要结合的关键性氨基酸残基:PHE-325,SER-390,GLN-277,TRP-219,MET-391等。另外,PxylAOX3的3D模型结构表明,它具有AOXs的保守域,例如含黄素的区域（FAD结合域）、两个假定的铁硫（2Fe-2S）氧化还原中心、钼辅因子结合位点,如Gln744、Tyr855、Pro970、Tyr974、Phe969和Glu1214。本研究综合分析了小菜蛾的酯类和醛类性信息素降解酶的酶学特性,为进一步解析蛾类性信息素分子感受机制提供了理论基础。同时,本研究也为小菜蛾的防治提供了新的防虫靶标基因。