β-榄香烯抑制骨肉瘤及增强阿霉素敏感性的机制研究

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背景:骨肉瘤是骨科中最常见的原发性恶性骨肿瘤之一,在儿童及青少年群体中好发,常通过血行转移,临床预后并不好,5年存活率为60%,但10年存活率不足30%,致残率和致死率都较高,给国家和社会造成了很大的负担。目前骨肉瘤治疗临床采取的最主要方式为手术结合化疗,即术前化学治疗+手术+术后化学治疗的方案;由于化疗药物的局限性,骨肉瘤的治疗在近40年来再无新的进展,亟需新的治疗方法或化疗药物的出现来提高骨肉瘤的预后。在骨肉瘤治疗的临床化疗方法中,阿霉素为主要的化疗药剂;但是,影响骨肉瘤化疗效果的一个主要原因是骨肉瘤细胞很容易就对阿霉素产生了耐药性;所以,提高骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性将是提高骨肉瘤治疗疗效的一个有效策略。β-榄香烯是一种从中药莪术中提取出来的具有抗癌作用的单体化合物,是我国研发并已批准可使用于临床的抗癌药物。大量研究表明,β-榄香烯具有抑制肿瘤发生发展、抗氧化反应、保护肝肾功能免受损、增强放化疗敏感性、调节免疫功能等多种作用;其最主要的特点是对人体多个系统的肿瘤如脑胶质瘤、白血病、甲状腺癌、肺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌等均具有抗癌作用。然而,β-榄香烯对骨肉瘤的相关研究的报道却较少,其对骨肉瘤具体的抗癌作用及可能存在的机制尚不完全清楚,亟需进一步研究。过氧化物酶1(Peroxiredoxin 1,Prx-1)是过氧化物酶家族中分布最广的家族成员,是一种具有调节细胞分化、增殖、凋亡、信号传导等多种生物学功能的抗氧化蛋白;其机制是主要通过催化H2O2和脂质氢过氧化物的还原反应来调节细胞内H2O2水平,从而起到调节细胞新陈代谢和信号传导的作用。相比较于正常细胞,肿瘤细胞中存在大量的氧化还原反应。而大量研究表明,在许多肿瘤细胞中,Prx-1都表达增高;同时,Prx-1对肿瘤细胞的生物学行为如增殖、凋亡等都能产生影响,并且,其还能够影响肿瘤细胞对放化疗的敏感性。有研究证实在骨肉瘤患者的病理组织中Prx-1的表达水平明显增高。然而,β-榄香烯能否通过调控骨肉瘤细胞中Prx-1的表达,进而对骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为及对化疗药物阿霉素的敏感性产生影响目前尚无研究。方法:在体外培养骨肉瘤MG63、Saos-2细胞系,使用CCK-8实验、流式细胞术、Western blot技术、Transwell实验等检测β-榄香烯对骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响并检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved caspase3的表达水平;在体内构建异种移植骨肉瘤荷瘤小鼠模型,观察β-榄香烯对荷瘤小鼠骨肉瘤瘤体生长的影响。另外,在体外培养骨肉瘤MG63、Saos-2细胞系并构建阿霉素耐药骨肉瘤细胞系MG63/Dox和Saos-2/Dox,利用CCK-8实验检测β-榄香烯和阿霉素对MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞的毒性作用,计算半数抑制浓度(IC50)和联合用药指数(CI);利用Edu染色、流式细胞术、Western blot技术、Elisa实验等检测β-榄香烯和阿霉素对MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞增殖、凋亡的情况及相关凋亡蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved caspase3的表达水平,并检测β-榄香烯和阿霉素对MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞中氧化应激的ROS、GSH表达水平和ERK/P38信号通路相关蛋白表达水平的影响。最后,利用Western blot技术检测β-榄香烯和阿霉素对MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞中Prx-1表达水平;并构建过表达Prx-1的MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞,利用CCK-8实验和Western blot技术检测β-榄香烯和阿霉素对过表达Prx-1的MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞活力和Prx-1表达水平的影响,探索Prx-1在其中可能发挥的作用;构建异种移植耐药骨肉瘤荷瘤小鼠模型,观察β-榄香烯和阿霉素对荷瘤小鼠Saos-2/Dox细胞瘤体生长的影响,并利用Western blot技术和免疫组织化学染色(IHC)分别检测瘤体组织中Prx-1的表达水平及瘤体血管生成情况,在动物体内探索β-榄香烯对Saos-2/Dox细胞的影响及可能作用机制。结果:β-榄香烯能够显著降低骨肉瘤细胞系MG63和Saos-2的增殖能力,诱导骨肉瘤细胞发生凋亡,抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭;并且在裸鼠体内可以抑制骨肉瘤的瘤体生长。此外,β-榄香烯和阿霉素联用可以显著抑制MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞的增殖,诱导凋亡,且发现二者联用可以增强MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞的氧化应激损伤和抑制ERK/P38信号通路。进一步研究发现,β-榄香烯和阿霉素联用能显著抑制MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞中Prx-1的表达,而过表达Prx-1后,MG63/Dox和Saos-2/Dox细胞活力明显升高;并且在裸鼠体内,二者联用可以显著抑制Saos-2/Dox细胞瘤体的生长,抑制瘤体组织中Prx-1的表达水平和血管生成。结论:β-榄香烯对骨肉瘤细胞具有抑制增殖、迁移和侵袭,诱导凋亡的作用,能够显著抑制骨肉瘤瘤体的生长。β-榄香烯和阿霉素具有协同抗肿瘤作用,二者联用可以抑制耐药骨肉瘤细胞的增殖,诱导其凋亡,其作用机制与诱导耐药骨肉瘤细胞氧化应激损伤和阻断ERK/P38信号通路有关。此外,β-榄香烯可以增强耐药骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性,逆转骨肉瘤细胞对阿霉素的耐药,其机制与抑制Prx-1的表达水平和抑制血管生成有关。
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