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禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC）作为一种革兰氏阴性菌,可引起禽类的气囊炎、败血症等。APEC的广泛传播及毒力对养殖行业已经造成了威胁。因此,研究APEC的毒力系统和致病机制具有较高的公共卫生学和防治意义。APEC毒力因子种类众多,VI型分泌系统（Type VI secretion systems,T6SS）通过分泌效应蛋白参与APEC的致病过程。其中,溶血素共调节蛋白（Hemolysin-coregulated protein,Hcp）在T6SS中参与组装与作用。先前研究已经证实hcp基因参与调控APEC的侵袭及种间竞争。然而,hcp编码蛋白对APEC特性及致病过程的具体调控机制尚不清楚。本研究构建了hcp基因过表达菌株,研究Hcp过度表达对APEC生物学特性的影响;通过组织载菌量试验检测了Hcp在APEC定植过程中的作用。为了探究Hcp在细菌间的抗菌活性,原核表达Hcp进行体外抑菌试验及大肠杆菌毒性试验,并进行转录组学测序;为进一步研究Hcp在APEC感染宿主过程中对NLRP3炎症小体的影响,通过已构建菌株或Hcp蛋白处理DF-1（鸡成纤维细胞）,利用RT-q PCR、ELISA方法测定NLRP3、Caspase-1基因m RNA水平及IL-18、IL-1β的分泌量。具体研究内容及结果如下:1.hcp基因对APEC生物学特性的作用通过构建hcp过表达株进行了生物学特性试验。结果表明hcp2a基因的过度表达使AE17生物被膜的形成能力增强（P＜0.01）。在H2O2、p H=5环境下,相比于野生株AE17,hcp2a、hcp2b基因过表达株生存能力降低（P＜0.01）。此外,在p H=10环境中,hcp2a、hcp2b基因过表达后,AE17的存活率无显著变化。hcp2a、hcp2b基因过度表达后,AE17抵抗血清杀菌能力显著下降（P＜0.01）。黏附能力测定结果显示,AE17-p STV28-hcp2a菌株细胞黏附率是对照菌株的5.66倍,hcp2a基因过表达后,AE17黏附能力显著增强,而hcp2b基因过表达后对AE17特性无明显影响。通过肌肉注射雏鸡,采集脑、肺进行组织载菌量试验。结果表明,Hcp活性蛋白注射组雏鸡脑、肺组织载菌量显著上升,提示hcp基因在APEC定植过程中发挥一定作用。2.Hcp蛋白的抗菌活性作用研究本研究进行了大肠杆菌毒性试验。结果表明,Hcp蛋白抑制大肠杆菌（BL21）的生长。试验菌株测序结果表明,Hcp2a蛋白共培组共筛选到1110个差异基因,其中418个基因上调,692个基因下调。GO注释表明,差异基因主要集中在核苷一磷酸代谢过程、嘌呤核苷三磷酸代谢、核糖核苷三磷酸代谢过程等条目,KEGG分析表明,差异基因主要集中在不同环境中的微生物代谢、氨基酸的生物合成、次生代谢物的生物合成等信号通路;Hcp2b蛋白共培组共筛选到983个差异基因,其中447个基因上调,536个基因下调。GO注释表明,差异基因主要集中在核苷三磷酸代谢过程、生物合成嘌呤核苷三磷酸、ATP生物合成过程等条目,KEGG分析表明,差异基因主要集中在丙酮酸代谢、丁酸甲酯代谢、脂肪酸降解等信号通路。表达、纯化Hcp蛋白进行微量抑菌试验,结果显示Hcp2a、Hcp2b蛋白对指示菌（CMCC44102、ATCC25923、ATCC9150、s5、s10）具有抑制效果,提示Hcp参与调控AE17细菌间生存。3.hcp基因构建株与Hcp蛋白对宿主炎症小体NLRP3的影响探究为了研究构建菌株和Hcp蛋白对宿主炎症小体的影响,本研究进行了RT-q PCR及ELISA试验。结果显示,相比于野生株AE17,△hcp2a菌株感染细胞的NLRP3、Caspase-1基因m RNA水平显著下调,细胞上清液中IL-1β、IL-18含量显著下降;△hcp2b菌株感染后NLRP3、Caspase-1基因m RNA水平明显下调,细胞上清液中IL-1β、IL-18分泌显著下降;当hcp基因过表达株处理细胞后,细胞中NLRP3基因m RNA水平相比于对照菌株显著上升;Hcp2a原核表达蛋白处理DF-1细胞后,细胞NLRP3基因m RNA水平相比于对照组显著上调。处理12h后,Hcp2a蛋白处理组IL-1β、IL-18分泌量显著上升;Hcp2b原核表达蛋白处理12h后,细胞NLRP3、Caspase-1基因m RNA水平显著上调,并且处理24h后,上清中IL-18含量出现显著上升。上述结果表明,hcp基因构建菌株及蛋白影响了NLRP3炎症小体的m RNA表达及细胞因子IL-1β、IL-18的分泌。综上所述,本研究成功构建T6SS-2 hcp基因过表达株,hcp基因过表达后影响AE17的生物被膜形成、环境耐受、抗血清杀菌和黏附细胞的能力;大肠杆菌毒性试验及转录组学测序表明Hcp蛋白通过影响大肠杆菌（BL21）代谢及氨基酸合成来抑制细菌生长,Hcp抑菌试验显示Hcp蛋白可抑制其他细菌生长,参与APEC细菌间竞争。此外,试验提示hcp基因编码蛋白影响NLRP3、Caspase-1基因m RNA的表达,并导致通路下游IL-1β、IL-18分泌量的变化。