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抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是昆虫安全过冬的重要抗冻保护物质之一。然而，近年研究发现，荒漠拟步甲科昆虫抗冻蛋白基因在夏季也有表达，并且低温、高温、干旱等非生物胁迫均能诱导抗冻蛋白基因的表达。体外实验证明荒漠昆虫抗冻蛋白还具有热保护作用和很强的结合水能力。因此，抗冻蛋白除了具有抗冻保护作用外，是否还具有帮助昆虫适应多种环境胁迫的作用，值得深入研究。黄粉虫(Tenebrio molitor)是一种拟步甲科仓储害虫，属于避冻昆虫，其幼虫可以忍受较低的温度，其抗冻蛋白的热滞活性很高，是第一个研究清楚的拟步甲科抗冻蛋白。由于荒漠昆虫抗冻蛋白的预测结构与黄粉虫抗冻蛋白十分相似，而黄粉虫购买方便，因此本研究以黄粉虫为研究材料，通过RNA干扰技术，进一步验证在非生物胁迫下抗冻蛋白对黄粉虫的保护作用。利用细菌表达的针对黄粉虫抗冻蛋白基因的dsRNA对大龄黄粉虫幼虫进行RNA干扰，再以低温、高温、干旱处理黄粉虫，测定胁迫下黄粉虫的相关生理指标、存活率和基因表达水平，对抗冻蛋白在黄粉虫抵抗非生物胁迫中的作用进行了初步研究。具体结果如下：1.对温度胁迫后的各发育阶段黄粉虫afp基因进行Real-time PCR检测发现38℃高温和4℃低温均能显著诱导黄粉虫afp基因的表达，其中小龄幼虫受温度诱导程度较弱，中龄幼虫、大龄幼虫和成虫对高温的响应十分强烈，基因在mRNA水平上调表达至对照的9.5~26.5倍，而对低温的响应程度类似，afp表达相比对照上调了4.7~7.1倍。在正常饲养条件下黄粉虫体内afp基因的基本表达水平受到发育阶段的调节，在大龄幼虫中表达量最高，因此选取大龄幼虫作为进一步RNAi实验的对象。2.针对黄粉虫抗冻蛋白基因AF160497(Tmafp433)设计干扰片段，构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115，筛选的阳性克隆经IPTG诱导后可以表达干扰Tmafp基因的特异dsRNA片段。提取纯化后注射黄粉虫大龄幼虫，对黄粉虫的存活造成一定影响，分析显示黄粉虫注射后的死亡率具有很高的剂量依赖性。Real-time PCR检测转录水平变化发现不同剂量的Tmafp-dsRNA均能显著抑制黄粉虫afp基因的表达，且抑制程度与注射剂量成正相关。Tmafp-dsRNA对Tmafp基因表达的抑制程度随注射后时间的推移呈先上升后下降的趋势，在3d达到最大，相比未注射组下降77.9%，持续至10d时仍与对照差异显著。3.对黄粉虫大龄幼虫afp基因进行RNA干扰后，检测其在低温、高温及干旱胁迫下的生理指标结果为：4℃驯化5h的未注射组黄粉虫在极端低温下(-13℃1h)的存活率显著上升，而RNA干扰后黄粉虫的低温存活率显著下降，其平均过冷却点(-10.4℃)显著高于对照组，血淋巴渗透浓度显著低于对照组，证明抗冻蛋白在低温下能够保护黄粉虫，提高耐寒性。38℃驯化5h后未注射组黄粉虫在极端高温下(45℃1h)的存活率明显上升，而RNAi后则显著下降，检测高温下RNAi后的黄粉虫afp基因表达规律显示其表达仍受到显著抑制，而对照组的afp基因则受到显著诱导表达，说明抗冻蛋白在黄粉虫抵抗高温胁迫时起重要作用。RNA干扰后的黄粉虫在干旱胁迫下失水速率明显高于对照组，说明抗冻蛋白能在一定程度上提高黄粉虫的耐脱水能力。