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目的:乳腺癌（Breast cancer,BC）是发生于乳腺上皮或导管上皮的恶性肿瘤,乳腺癌的发病率逐年升高。其中,三阴性乳腺癌多发生于年轻患者,相比于其他亚型乳腺癌患者预后较差,即使在早期发现后尽早采取手术,术后复发转移率仍较高。尽管近年来由于化疗药的不断开发,乳腺癌的预后有所改善,但是化疗过程中的耐药现象给乳腺癌患者带来了巨大的威胁。越来越多的研究提示乳腺癌化疗耐药可能是由于靶点相对单一,因此,阐明BC发生发展过程中潜在的分子机制,开发新的治疗靶点对于改善乳腺癌患者预后至关重要。FAM111 trypsin like peptidase B（FAM111B,NM＿198947）位于人类染色体11q12.1上,编码在C端具有胰蛋白酶样半胱氨酸/丝氨酸肽酶结构域的蛋白质。研究表明FAM111B可能是一种致癌基因,相关文献显示FAM111B在肺癌、宫颈癌、前列腺癌中发挥促癌作用。但至今为止,FAM111B在恶性肿瘤中特别是在三阴性乳腺癌中的作用仍不明确。因此本课题将研究FAM111B在三阴性乳腺癌中的表达情况,探索FAM111B表达水平与三阴性乳腺癌临床预后的相关性,明确FAM111B在三阴性乳腺癌中发挥促癌效应的分子机制及其对紫杉醇化疗耐药的影响,进而阐明FAM111B在三阴性乳腺癌治疗中的临床应用价值。方法:第一部分:FAM111B在乳腺癌中的表达模式分析及其同乳腺癌预后的相关性解析。1.利用TGGA数据库分析研究FAM1111B在人类泛癌组织中的表达水平;FAM1111B表达水平与乳腺癌分期的相关性。2.利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析FAM111B高低表达与乳腺癌总生存的关系。3.免疫组织化学方法检测FAM111B在三阴性乳腺癌中和正常乳腺组织中的表达水平差异;卡方检验分析三阴性乳腺癌组织中FAM111B表达与临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析FAM111B表达水平与患者总生存之间的关系。第二部分:FAM111B在体内、外实验中对三阴性乳腺癌生物学行为及紫杉醇耐药的影响。1.Western blot检测FAM111B在人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1806、HCC1937和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达水平,选择一株FAM111B表达较高的细胞（H）和一株表达较低的细胞（L）,进行后续实验。2.通过免疫荧光检测FAM111B在高表达和低表达细胞中的表达水平和定位。3.将FAM111B过表达质粒（FAM111B-OE）及其对照（Vector）转染至FAM111B低表达细胞中,同时将2条FAM111B干扰片段（FAM111B si RNA1、FAM111B si RNA2）及其对照（NC si RNA）转染至FAM111B高表达细胞中,通过Real-time q PCR和Western blot检测FAM111B的表达水平;转染0 h、24 h、48 h、72 h和96 h后,通过CCK-8验证细胞增殖情况;转染48 h后,流式检测细胞周期分布;转染48 h后,Western blot检测细胞中cyclin D1、cyclin E、PCNA和p16的表达;转染48 h后,利用流式（Annexin V/PI染色）检测细胞凋亡;转染48 h后,利用Hoechst 33258染色检测细胞凋亡;转染48 h后,Western blot检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved-PARP1和PARP1的表达。4.用不同浓度（2、5、10、20μmol/L）紫杉醇paclitaxel（PTX）处理FAM111B低表达细胞24 h,利用CCK-8检测细胞活力;将FAM111B低表达细胞转染FAM111B-OE或Vector,24 h后,用对应的1/2浓度的PTX处理细胞24 h,通过CCK-8检测细胞活力;通过流式（Annexin V/PI染色）检测细胞凋亡;通过Western blot检测细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved-PARP1和PARP1的表达,分析FAM111B对乳腺癌细胞紫杉醇化疗敏感性的影响。5.通过裸鼠皮下种植瘤实验探究FAM111B在体内对于三阴性乳腺癌细胞增殖能力、凋亡能力的影响。第三部分:转录因子HOXC8调控FAM111B的表达1.利用生物信息学网站JASPAR在线预测HOXC8与FAM111B启动子存在结合位点,提示FAM111B可能由HOXC8转录调控。采用NCBI查找人源FAM111B转录起始前2000 bp作为启动子区域。构建调控基因HOXC8表达载体,转染细胞,进行双荧光素酶实验验证HOXC8对FAM111B的转录调控。2.然后采用免疫染色质共沉淀（CHIP）实验验证HOXC8与FAM111B之间的靶向关系。3.利用sh RNA构建敲低HOXC8三阴性乳腺癌细胞系,通过Real-time PCR及Western blot验证敲低效率后,观察FAM111B在m RNA及蛋白质水平的表达变化情况。结果:第一部分:FAM111B在乳腺癌中的表达模式分析及其同乳腺癌预后的相关性解析。1.与非肿瘤组织相比,TGGA数据库分析发现FAM111B在以下类型的癌症中表达明显上调,BLCA（膀胱尿路上皮癌）、BRCA（乳腺浸润癌）、COAD（结肠癌）、ESCA（食管癌）、LUAD（肺腺癌）、LUSC（肺鳞癌）、PCPG（嗜铬细胞瘤和副神经节瘤）、STAD（胃癌）和UCEC（子宫内膜癌）、KIRC（肾透明细胞癌）,KIRP（肾乳头状细胞癌）。此外,与正常组织相比,READ（直肠腺癌）、和THYM（胸腺癌）、SKCM（皮肤黑色素瘤）,FAM111B表达水平明显降低;基于TCGA数据库获得,与癌旁乳腺癌组织相比,乳腺癌FAM111B的表达显著升高。2.通过数据库还获得与乳腺癌旁组织相比,在乳腺癌的I-IV期中FAM111B的表达水平也明显升高,每组间均具有统计学意义;FAM111B与乳腺癌的分期呈现正相关。3.采用Kaplan-Meier Plotter网站发现,相比于FAM111B低表达水平的乳腺癌患者,FAM111B高表达水平的乳腺癌患者的总生存期显著缩短。4.FAM111B在三阴性乳腺癌组织及细胞中呈现阳性表达,并且主要表达在细胞核内,细胞质中也有分布。FAM111B在正常乳腺组织中呈阴性表达或弱表达,而FAM111B在三阴性乳腺癌组织中阳性表达,表达量较正常乳腺组织较高。5.通过对三阴性乳腺癌患者的临床病理资料进行统计分析,FAM111B在肿瘤组织的高表达与患者的临床分期及淋巴结转移相关;通过统计患者的生存随访数据,48例三阴性乳腺癌患者中,FAM111B高表达患者总生存较FAM111B低表达患者短。第二部分:FAM111B在体内、外实验中对三阴性乳腺癌生物学行为及紫杉醇耐药的影响。1.通过Western blot检测获得FAM111B在三阴性乳腺MDA-MB-468细胞中表达水平最高,而在三阴性乳腺癌HCC1806细胞表达水平最低。2.免疫荧光检测获得FAM111B在乳腺癌细胞系中高表达,主要位于细胞核中。3.将FAM111B过表达质粒转染至低表达细胞中、FAM111B转染至高表达细胞中后,通过Real-time q PCR和Western blot检测FAM111B的表达水平,结果显示转染效率良好;HCC1806细胞中,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,其细胞活性显著增加,MDA-MB-468细胞中,FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,其细胞活性极显著减少。4.HCC1806细胞中,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,其G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,G2期细胞比例由减少。MDA-MB-468细胞中,FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,其G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,G2期细胞比例由增加。HCC1806细胞中,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,cyclin D1、Cyclin E、PCNA的蛋白表达水平均升高,p16的蛋白表达水平降低;MDA-MB-468细胞中,FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,cyclin D1、Cyclin E、PCNA的蛋白表达水平均降低,p16的蛋白表达水平升高。5.MDA-MB-468细胞中,FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,细胞凋亡率均极显著增加;细胞核呈亮蓝色荧光,FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,细胞凋亡率均极显著增加;FAM111B1/2干扰载体转染组与对照转染组相比,Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1的蛋白表达水平均升高,Bcl-2的蛋白表达水平降低。6.HCC1806细胞中,当紫杉醇浓度为0.01 nmol/L时,其细胞抑制率与空白组细胞相比,差异不显著;当紫杉醇浓度分别为0.1、1、10、100、1000 nmol/L时,其细胞抑制率与空白组细胞相比,均呈极显著增加;紫杉醇处理后,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,其细胞活性显著增加;紫杉醇处理后,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,其细胞凋亡率极显著减少;紫杉醇处理后,FAM111B过表达载体转染组与空载体转染组相比,cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP1的蛋白表达水平均降低。7.裸鼠皮下种植瘤模型结果表明FAM111B高表达组的肿瘤体积和质量（0.78±0.21cm3,0.44±0.11g）,明显高于其对照组的肿瘤体积和质量。瘤体组织HE染色显示:与sh RNA-NC组比较,FAM111B-sh RNA组肿瘤组织可见细胞核碎片,凋亡细胞增多。TUNEL染色检测瘤体组织细胞凋亡情况显示,与sh RNA-NC组比较,FAM111B-sh RNA组肿瘤组织细胞凋亡数目明显增加。第三部分:转录因子HOXC8调控FAM111B的表达1.双荧光素酶实验证明HOXC8对FAM111B的转录调控。2.CHIP实验证明HOXC8能与FAM111B的上游705-712位点:ACAATTAT序列结合。3.利用sh RNA抑制HOXC8的表达后,HOXC8及FAM111B在RNA及蛋白质水平明显降低。结论:1.三阴性乳腺癌中,FAM111B的表达水平明显高于正常乳腺组织;FAM111B蛋白表达水平与三阴性乳腺癌的临床分期和淋巴结转移显著相关;FAM111B的表达水平与三阴性乳腺癌患者的总生存呈负相关。2.FAM111B在三阴性乳腺癌细胞系中高表达,主要表达在细胞核内,细胞质中也有分布。3.FAM111B促进三阴性乳腺癌细胞增殖,促进细胞分裂周期进程,抑制肿瘤细胞凋亡;FAM111B高表达提高了三阴性乳腺癌细胞在紫杉醇诱导处理下的活力,抑制细胞的凋亡,增加乳腺癌细胞对紫杉醇的化疗耐药性。4.转录因子HOXC8能够与FAM111B上游启动子区域结合,使其转录增强,FAM111B表达升高,促进三阴性乳腺癌的发展。