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目的:本研究基于胆汁DNA中突变和甲基化的平行分析,拟建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,为目前临床中经内窥镜逆行胰胆管造影术（ERCP）诊断结果不明确的患者提供辅助性诊断的方法,从而提高胆胰系统疾病中恶性肿瘤的检出率,使患者能更及时、准确的就诊,提高患者的治愈率及生存水平。内容:本研究共采集来自5家医院的259例胆汁样本,通过提取胆汁中DNA并分析DNA的基因突变和甲基化差异,结合临床的诊断结果,建立并优化胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,并在测试数据集中对ERCP诊断结果不明确的患者进行恶性肿瘤的检测及灵敏度和特异度分析。同时将Bilescreen的检测结果,相应患者的血清CA19-9的检测结果以及两者联合的检测结果对胆胰系统良恶性疾病的诊断能力进行比较。另外,本文还对部分患者胆汁样本中微生物的分布情况进行研究,分析微生物菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。方法:收集胆胰系统疾病患者的胆汁样本,分为训练数据集、验证数据集和测试数据集,分别提取胆汁样本中的DNA,以qPCR技术对胆汁DNA所含人源DNA和细菌DNA进行定量检测。对于人源DNA含量较高的样本,利用Mutation Capsule的实验方法进行二代测序文库构建,分析胆汁DNA中基因突变和甲基化的测序结果;通过分析训练数据集中基因突变和甲基化差异与临床诊断为胆胰系统良恶性疾病的患者相关性,建立胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型（Bilescreen）,将Bilescreen在验证数据集中进行参数优化,在测试数据集中进行恶性肿瘤辅助诊断。同时收集患者的血清CA19-9的检测结果,根据患者的临床信息分析比较血清CA19-9、Bilescreen的检测结果对这部分患者的诊断的灵敏度和特异度。对于胆汁中细菌DNA含量较高的样本,使用16S rDNAV4扩增子测序技术对胆汁中细菌DNA的V4区域进行扩增以及二代测序,根据测序结果分析微生物菌群在胆胰系统疾病患者胆汁中的分布,比较菌群分布与胆胰系统良恶性疾病的相关性。成果:在训练数据集样本中,血清CA19-9与Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测诊断恶性肿瘤的灵敏度相当,分别是88.10%和90.48%;Bilescreen中基于胆汁DNA的突变检测诊断恶性肿瘤的特异度为100%,DNA突变结合甲基化检测诊断恶性肿瘤的特异度为97.56%,而血清CA19-9检测的特异度只有65.85%。在ERCP不能明确诊断的测试数据集样本中,Bilescreen中基于胆汁DNA的突变和甲基化检测恶性肿瘤的灵敏度为83.87%,特异度为85.71%,而血清CA19-9对恶性肿瘤诊断的灵敏度为83.87%,但特异度仅有14.29%。在胆汁微生物分析中,本研究发现胆胰系统良性疾病患者组中主要存在的细菌门是厚壁菌门（Firmicutes）,在胆胰系统恶性肿瘤患者组中主要存在的细菌门是变形菌门（Proteobacteria）。这两种主要的细菌门在良恶性组别患者中的分布未见显著差异（p=0.267和p=0.215）。在细菌科的差异分析中,本研究发现6种细菌科显著富集于胆胰系统恶性肿瘤患者组样本中,分别是气单胞菌科（Aeromonadaceae,p=0.019）,毛螺菌科（Lachnospiraceae,p=0.030）,微杆菌科（Microbacteriaceae,p=0.045）,紫单胞菌科（Porphyromonadaceae,p=0.030）,普雷沃氏菌科（Prevotellaceae,p=0.045）和韦荣氏菌科（Veillonellaceae,p=0.045）。结论:本研究通过对胆汁中DNA进行二代测序分析,构建基于胆汁DNA中基因突变和甲基化检测的胆胰系统恶性肿瘤辅助诊断模型,在两个维度上对于胆胰系统恶性肿瘤进行诊断预测,其诊断能力与目前临床中常规的诊断结果相当。本方法还可以对ERCP不能明确诊断的患者进行有效的恶性肿瘤辅助诊断,或有望在今后的临床的辅助诊断中得到应用。同时,本研究还在胆胰系统恶性肿瘤患者胆汁中发现特异的细菌科,说明胆胰系统良恶性疾病患者胆汁中微生物的分布存在差别,该指标有望作为另一个维度的生物学标记物,提高对胆胰系统良恶性疾病的诊断水平。目的:本研究通过测序分析抗PD-1免疫抑制剂治疗晚期胸部肿瘤患者的有效组和无效组基线粪便样品中的肠道菌群差异,探讨了在抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中患者基线粪便样品中肠道菌群差异与免疫治疗疗效之间的关系。期望以患者基线粪便样品中与抗PD-1免疫抑制剂治疗疗效相关的差异菌种作为生物标记物,在治疗前预测免疫治疗疗效,使更多患者从免疫治疗中获益。内容:本研究探讨了在晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫抑制剂治疗过程中,基线粪便样品中肠道菌群与免疫治疗疗效之间的关系。首先收集在接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者的基线以及治疗期间的粪便样本,通过提取粪便样本中细菌DNA、建立16S rDNAV4扩增子文库,并进行16S rDNAV4测序;通过对测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间的粪便样品中肠道菌群Alpha多样性和Beta多样性方面的区别以及肠道菌群的分布情况,并进一步确定两组患者肠道菌群在细菌科水平的差异菌种;结合临床资料分析患者免疫治疗的疗效与差异菌种的相关性。方法:本研究入组42名接受抗PD-1治疗的晚期胸部肿瘤患者,收集患者的基线以及治疗期间的粪便样本,提取粪便样品中细菌DNA并构建16S rDNA V4扩增子文库进行二代测序。以测序结果分析治疗有效组患者和治疗无效组患者基线和治疗期间粪便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样性方面的区别,以及两组患者肠道菌群在细菌门水平和细菌科水平的组成成分的差异。使用客观反应率、疾病控制率作为近期疗效,疾病无进展期和总生存期作为远期疗效,评估基线肠道菌群中菌种差异对患者的临床治疗效果的影响。采用单因素分析和多因素回归分析对患者免疫治疗的疾病无进展期有影响的肠道菌群和临床资料特征。结果:免疫治疗有效组患者（n=23）和无效组患者（n=19）的基线便样品中肠道菌群在Alpha多样性和Beta多样分析中无显著性差异。在基线便样品中肠道菌群的细菌门水平的分析中,主要分布的细菌门类是厚壁菌门（Firmicutes）,拟杆菌门（Bacteroidetes）,变形杆菌门（Proteobacteria）和放线杆菌门（Actinobacteria）,两组患者在细菌门类的分布没有显著差异。在细菌科水平的分析中,免疫治疗有效组患者的基线便样品中有5类细菌科的相对丰度显著高于免疫治疗无效组,它们分别是阿克曼菌科（Akkermansiaceae）,肠杆菌科（Enterobacteriaceae）,梭菌目分类下的Family Ⅺ科（Clostridiales family XI）,肉杆菌科（Carnobacteriaceae）,肠球菌科（Enterococcaceae）。以这5类细菌科作为一个共生菌混合物,可有效的区分有效组患者和无效组患者（p=0.014）,且患者在免疫治疗前具有更高丰度的该类共生菌混合物时疾病无进展期显著延长（p=0.00016）。多因素回归分析显示,基线便样品中肠道菌群共生菌混合物的丰度是影响晚期胸部肿瘤患者抗PD-1免疫治疗的中位疾病无进展生存期的独立风险因素（HR=0.17,95%CI为0.05-0.55,p=0.003）。另外,在免疫治疗期间患者肠道菌群中共生菌混合物的丰度是存在一定波动的,但是其变化未见显著差异（p=0.878）。结论:晚期胸部肿瘤患者治疗前的便样品中肠道菌群组成成分及其丰度对抗PD-1免疫治疗有重要影响。基线肠道菌群中共生菌混合物（即阿克曼菌科,肠杆菌科,梭菌目分类下的Family XI科,肉杆菌科,肠球菌科）有望成为晚期胸部肿瘤患者进行抗PD-1免疫治疗疗效预测的生物标记物,通过检测其丰度可对抗PD-1免疫治疗疗效进行有效预测。