第一部分基于生物信息学探讨ZEB1对上皮性卵巢癌多药耐药的潜在机制目的:卵巢癌是一种早期隐匿、预后差,对传统治疗有耐药性的疾病。化疗药物的耐药和上皮性卵巢癌细胞易侵袭转移的特性是导致其生存率低的主要原因。Mi RNA-429是细胞内源性非编码类小RNA,能与靶基因3’端非编码序列结合并调节其翻译来显示功能。ZEB1在肿瘤化疗耐药和侵袭方面发挥关键作用,但其在卵巢癌多药耐药中的机制尚不明确。在这篇章节中,我们通过生物信息学方法研究探讨ZEB1影响卵巢癌多药耐药的潜在作用机制,为进一步为治疗卵巢癌耐药、寻找高敏感性、高特异性的肿瘤标志物提供一种新的思路。方法:通过生物信息学方法分析ZEB1 m RNA在卵巢癌与正常卵巢上皮、卵巢耐药组织与敏感组织中的表达情况;Pearson Text检测miR-429与ZEB1/2之间的关系;通过生物信息学寻找与ZEB1相关的卵巢癌耐药基因及蛋白,使用DAVID数据库进行KEGG通路富集;Kaplan Meier Plotter数据库分析ZEB1/2对卵巢癌患者的预后,基于TCGA数据库分析ZEB1表达水平与各临床因素的相关性,多因素COX回归分析病理参数对卵巢癌预后的影响;回顾分析我院临床组织（29例耐药vs 41例敏感）中miR-429与ZEB2 m RNA的表达量,卡方检验分析miR429表达水平与临床病理因素之间的相关性、Kaplan Meier法分析其对卵巢癌预后的影响,单因素COX比例风险模型评估独立危险因素,以及ROC曲线分析它们作为卵巢癌多药耐药诊断的意义。结果:生物信息学发现ZEB1 m RNA在卵巢癌组织中的表达高于正常卵巢上皮组织。TCGA数据库分析结果显示miR-429在耐药样本中的表达低于敏感样本（P=0.45＞0.05）,未具有统计学意义;ZEB1/2在耐药样本中的表达高于敏感样本（P＞0.05）,但未达到统计学意义;发现miRNA-429/miRNA-200c是ZEB1预测靶向miRNA,ZEB1是miRNA-429/miRNA-200c的预测靶向基因。通过Pearson Text分析TCGA卵巢数据,结果显示miR-429与ZEB1/2呈负性调控,且ZEB1/2亦可负性调控miR-429（P＜0.05）。分析广西医科大学附属肿瘤医院的OC患者的组织标本（41例铂类敏感组织vs 29例铂类耐药组织）,发现miR429在耐药组织中的表达低于OC敏感组织,差异具有统计学意义（P=0.0002,P＜0.05）,而与ZEB1同属于ZEB家族的ZEB2在耐药组织中的表达却高于OC敏感组织,未达到统计学意义（P=0.1635,P＞0.05）,但表达趋势与生物信息学分析一致。此外,通过生物信息学我们筛选出3个与ZEB1中度相关的OC耐药候选基因TIMP3、COMP、PTGER3及10个与ZEB1互作的关键蛋白（AKT1,CD44,FN1,TP53,CDH1,SOX2,NOTCH1,VEGFA,MYC,GAPDH）,KEGG通路主要富集在癌症中的蛋白聚糖,癌症通路,癌症中的mirco-RNA,PI3K-Akt信号通路,焦点粘连,ECM-receptor相互作用,MAPK信号通路、HIF-1信号通路、调控干细胞多能性的信号通路、Rap1信号通路、Hippo信号通路等。ZEB1/2m RNA水平的上调与卵巢癌患者的OS和PFS的降低性显著相关,多因素Cox回归分析TCGA临床数据,发现高龄、耐药,stage III期、IV期以及治疗反应中的完全缓解（CR）等因素可能是影响卵巢癌患者预后的独立因素。最后,我们的临床随访数据显示miR429的上调有益于卵巢癌患者的预后,但未达到统计学意义（OS:P=0.188;PFS:P=0.189）。ZEB2表达量上调的卵巢癌患者显示较差的预后,具有统计学意义（OS:P=0.038;PFS:P=0.006）;且发现miR-429的表达与卵巢癌耐药与否、治疗反应相关（P＜0.05）;ROC曲线还显示miRNA-429联合ZEB2（AUC:77.3%,P＜0.0001）诊断卵巢癌多药耐药的准确性大于miR-429（AUC:76.2%,P＜0.0001）或ZEB2（AUC:70.6%,P＜0.001）的单一指标。结论:miR-429、ZEB1在卵巢癌的发生发展及耐药中具有重要作用。DNA水平层面上,筛选出3个与ZEB1中度相关的OC耐药候选基因（TIMP3,COMP,PTGER3）。m RNA水平层面上,miR-429与ZEB1/2之间可能存在一个双反馈环路,且呈负性调控。蛋白水平层面上,筛出10个与ZEB1互作的关键蛋白（AKT1,CD44,FN1,TP53,CDH1,SOX2,NOTCH1,VEGFA,MYC,GAPDH）。在ZEB1的基因表达过程中,其可能通过调控以上基因、micro RNA及蛋白来参与涉及卵巢癌的多药耐药机制,以及ZEB1/2可能与卵巢癌患者的不良预后显著相关。此外,我们的临床随访数据还显示miR-429与卵巢癌耐药与否、治疗反应相关;ZEB2对于卵巢癌患者的预后有一定指示作用,以及miR429+ZEB2联合指标对卵巢癌多药耐药的诊断具有一定意义。第二部分ZEB1调控卵巢癌铂类耐药细胞的生物学效应研究目的:探究ZEB1对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP、A2780/DDP的增殖、侵袭、凋亡及衰老等生物过程的变化,以明确ZEB1在卵巢癌耐药中的生物学作用。方法:慢病毒感染靶细胞;荧光定量PCR检测SKOV3、SKOV3/DDP、SKOV3/DDP+LV-si ZEB1、SKOV3/DDP+LV-NC、A2780、A2780/DDP、A2780/DDP+LV-si ZEB1及A2780/DDP+LV-NC细胞中ZEB1 m RNA水平表达量;CCK8法检测上述各组细胞的IC50值及其增殖能力。Transwell法检测在一定顺铂浓度作用下各组细胞的侵袭能力;流式细胞仪检测一定顺铂浓度作用下,各组细胞的凋亡情况;β-半乳糖苷酶试剂盒检测顺铂药物预处理后各组细胞的衰老情况。结果:荧光定量PCR结果表明卵巢癌铂类耐药细胞株SKOV3-DDP及A2780-DDP中的ZEB1 m RNA水平表达量高于铂类敏感细胞株SKOV3及A2780细胞。SKOV3/DDP+LV-si ZEB1,A2780/DDP+LV-si ZEB1两组细胞中的ZEB1 m RNA水平表达量分别较其阴性对照组及耐药细胞组低;CCK8法检测结果表明SKOV3/DDP+LV-si ZEB1、A2780/DDP+LV-si ZEB1组细胞的IC50值较其空白组及阴性对照组低。且在一定浓度的顺铂干预下,SKOV3/DDP+LV-si ZEB1及A2780/DDP+LV-si ZEB1组的增殖能力分别较其阴性对照组减弱;Transwell法结果表明在一定浓度的顺铂药物处理下,SKOV3/DDP+LV-si ZEB1组细胞的侵袭能力较SKOV3/DDP+LV-NC组及SKOV3/DDP组减弱;流式细胞仪检测结果表明在一定顺铂浓度干预下,SKOV3/DDP+LV-si ZEB1及A2780/DDP+LV-si ZEB1组凋亡情况较其阴性对照组增强;β-半乳糖苷酶试剂盒检测结果表明A2780/DDP+LV-si ZEB1的衰老情况较阴性对照组增强。结论:在一定浓度顺铂作用下,下调ZEB1可抑制卵巢癌耐药细胞增殖、侵袭等生物过程,且有助于促进其凋亡及衰老的发生。因此,ZEB1可能通过调控以上生物学作用来影响卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂药物的敏感性。第三部分miR-429/ZEB1轴调控铂类耐药卵巢上皮癌细胞铁死亡的研究目的:Mi RNA-429是细胞内源性非编码类小RNA,能靶向结合目标基因并调节翻译来显示其功能,参与了卵巢癌的发生发展、迁移侵袭及耐药。锌指E盒同源结合蛋白1（ZEB1）隶属于ZEB蛋白家族之一,它在上皮-间质转化、DNA修复、干细胞生物学和肿瘤诱导免疫抑制等方面发挥重要作用。近些年,新发现的一种以铁依赖的、脂质活性氧聚集为特征的,不同于凋亡形式的细胞死亡,称之为铁死亡。使用药物诱导卵巢癌细胞铁死亡成为了卵巢癌治疗的新方向,但其中机制仍未阐明。有关文献预测ZEB1参与卵巢癌铁死亡模型的构建,然而其在卵巢癌细胞铁死亡中的功能和机制未见报道。课题组前者研究从体内、体外证实ZEB1是miRNA-429的靶向基因,且发现过表达miR429可以下调ZEB1的表达。基于以上研究,本课题旨在探索miR429/ZEB1轴在铂类耐药卵巢上皮癌细胞铁死亡模型中的生物学功能及机制,为卵巢癌耐药机制的研究提供一种新的思维方式。方法:CCK-8法、吉母萨染色法、流式细胞仪及Western Blot验证是否成功构建铂类耐药卵巢癌细胞铁死亡模型;CCK-8法、吉母萨染色法检测Erastin诱导下的过表达429及干扰ZEB1对铂类耐药卵巢癌细胞的死亡情况。结果:本研究中,我们首先发现Erastin可以诱导铂类耐药卵巢上皮癌细胞SKOV3/DDP及A2780/DDP细胞发生铁死亡。从吉姆萨染色结果发现Erastin诱导的细胞可发生细胞胞浆皱缩,整个细胞呈圆球形。通过流式细胞仪检测进一步发现Erastin可诱导细胞内Lipid-ROS的产生,而该过程可被铁死亡抑制剂Ferrostatin-1所缓解。同时,在Erastin诱导过程中,铁死亡相关蛋白GPX4表达随着铁死亡诱导剂Erastin剂量的增加而呈表达下调的趋势。因此,从形态学、生物学及蛋白组水平结果均证实符合铁死亡的特征。其次,在前者研究基础上,我们运用CCK-8法及吉姆萨染色法实验证明了miR-429可加快Erastin诱导的铂类耐药卵巢上皮癌细胞的死亡过程。课题组前期已经证实锌指E盒同源结合蛋白1（ZEB1）是miRNA-429的靶向基因,且可下调ZEB1。于是,我们通过慢病毒介导的ZEB1下调,发现CCK-8及吉母萨染色实验的结果显示其增强了Erastin诱导的铂类耐药卵巢上皮癌细胞的铁死亡。结论:成功构建了铂类耐药卵巢上皮癌细胞的铁死亡模型,以铂类耐药卵巢上皮癌细胞铁死亡为研究基础,证明了miR-429对铂类耐药卵巢上皮癌细胞铁死亡的促进作用,阐明了miR-429促进Erastin诱导的铂类耐药卵巢癌细胞铁死亡可能是通过下调ZEB1介导的新机制,为卵巢癌耐药的治疗提供了一种新的策略和理论依据。