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目的神经元的轴突再生取决于自身的再生能力及其外部环境因素。神经损伤之后,轴突再生受到各种信号传导通路的严密调节。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)作为端粒酶的重要催化亚基,p53基因作为重要的转录因子,均可调控细胞增殖、细胞生长及凋亡等多种生理活动,此外,已有研究表明,TERT和p53之间存在功能上的联系。因此,本课题拟探讨神经损伤后,TERT/p53信号通路对轴突再生的调控作用。方法1.本研究采用小鼠坐骨神经损伤模型,损伤1、3、7天后,利用qPCR和Western Blot 检测背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元中 TERT、p53 的 mRNA 和蛋白表达水平变化。2.体外培养小鼠的DRG神经元,通过化学抑制剂、特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制TERT和p53的活性,培养3天后,用神经元的标记物通过免疫荧光染色特异性标记轴突并测量其长度,以此判断TERT和p53对轴突再生的影响。3.体外培养小鼠的DRG神经元,通过特异性激活剂提高TERT和p53的活性,培养2天后,用神经元的标记物通过免疫荧光染色特异性标记轴突并测量其长度,以此判断TERT和p53对轴突再生的影响。4.体外培养胚胎E18海马神经元和E15皮层神经元,通过p53抑制剂PFTα及激活剂Tenovin-6调控p53表达水平,培养3天后,用神经元的标记物通过免疫荧光染色特异性标记轴突并测量其长度,以此判断p53对海马神经元和皮层神经元轴突再生的调控作用。5.将TERT特异性siRNA或pEX-3-p53质粒与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)质粒的混合物转染入与坐骨神经相连的第四、五腰椎(Lumbar4-5,L4-5)DRG神经元内。2天后,夹伤坐骨神经中的神经纤维,损伤3天后,分析其轴突再生情况。6.利用视神经损伤模型,将AAV2-p53病毒载体显微注射入玻璃体内,以AAV2-GFP病毒载体作为对照。显微注射2周后,夹伤视神经,并于夹伤2周后将Alexa488-CTB显微注射入玻璃体内,顺行标记视神经再生轴突,2天后,用4%多聚甲醛固定视神经,之后依次用10%、20%、30%(w/v)的蔗糖溶液进行梯度脱水,经冰冻切片后,在荧光显微镜下观察视神经的轴突再生情况。结果1.TERT调控感觉神经元的轴突再生a.小鼠坐骨神经损伤后,DRG神经元中TERT的mRNA及蛋白表达升高,且以第3天最为明显,呈现先上升后下降的趋势;b.使用特异性化学抑制剂BIBR 1532降低TERT活性后,体外培养DRG神经元的轴突再生受到抑制;c.使用特异性siRNA抑制TERT活性后,体外培养DRG神经元及体内坐骨神经的轴突再生能力明显减弱;d.相反,使用激活剂CAG提高TERT活性后,显著促进了体外培养DRG神经元的轴突再生。2.p53调控感觉神经元及中枢神经元的轴突再生a.小鼠坐骨神经损伤后,DRG神经元中p53的蛋白表达升高;b.使用特异性膜可渗透的抑制剂PFTα降低p53活性后,体外培养DRG神经元的轴突再生受到抑制。经检测,海马神经元及皮层神经元中的轴突再生情况与DRG神经元呈现一致的趋势;c.相反,使用特异性激活剂Tenovin-6提高p53活性后,显著促进了体外培养DRG神经元的轴突再生。经检测,海马神经元及皮层神经元中的轴突再生情况也同样与DRG神经元呈现一致的趋势;d.此外,p53过表达显著促进了体内坐骨神经的轴突再生;e.玻璃体内显微注射AAV2-p53病毒载体后,显著促进了视神经损伤后的轴突再生。3.TERT通过p53调控感觉神经元的轴突再生a.在体外培养的DRG神经元中,TERT特异性抑制剂BIBR 1532降低了 TERT的蛋白表达,同时也导致p53的蛋白表达水平显著降低;b.在体外培养的DRG神经元中,p53激活剂Tenovin-6可在一定程度上逆转由TERT siRNA干扰引起的感觉轴突再生抑制。结论神经损伤后的轴突再生是一个复杂的生物学过程,受各种基因的严格调控。一般情况下,神经损伤后相关的转录因子会被激活,从而确保轴突生长期间所需的蛋白质合成。本研究的结果表明,端粒酶逆转录酶和转录因子p53在神经损伤后的轴突再生过程中发挥重要的调节作用。总之,这一研究不仅首次证明了 TERT可以调节感觉神经元的轴突再生,而且揭示了TERT通过p53调控轴突再生的分子机制,更为重要的是,p53过表达可以显著促进视神经损伤后的轴突再生。