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组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(Histone Lysine Specific Demethylase 1,LSD1)自2004年被鉴定为第一个组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶后,可逆的蛋白质甲基化的分子生物学研究便进入一个新的发展阶段。由于LSD1能够通过去除组蛋白和其他非组蛋白底物的单、双甲基化,进而影响基因转录的激活、抑制和染色体失活等过程。众多研究者认为LSD1表达量的改变已成为肿瘤发生的一个主要特征,同时,LSD1被报道是多种肿瘤的关键调控因子,抑制LSD1可以诱导肿瘤细胞分化,抑制肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等特性。因此,本课题主要以LSD1为研究对象,探索发现其高效、高选择性的小分子化合物及相关调控机制。近些年来,众多LSD1抑制剂的研究者依据MAO-A/B的抑制剂2-PCPA的结构来设计合成小分子LSD1抑制剂。尽管得到一些活性较好的化合物,且部分已进入临床实验,但临床数据显示化合物存在一定局限性及副作用。因此,寻找高效、高选择性的化合物依然是目前严峻的挑战。本课题主要研究内容及结果:(1)LSD1重组蛋白的表达纯化及小分子抑制剂的筛选本课题应用并优化了课题组前期构建的LSD1表达纯化方法,通过文献调研及实验经验,将平衡柱子的咪唑缓冲溶液浓度提高后,一步纯化法就得到纯度较高的LSD1重组蛋白。并且,本课题应用此蛋白结合课题组前期构建的LSD1小分子抑制剂筛选方法,筛选了课题组内设计合成的及在天然产物中提取的小分子化合物。(2)天然产物类LSD1抑制剂对LSD1重组蛋白及胃癌细胞的抗肿瘤作用研究本课题对课题组内提取的天然产物库进行筛选,得到MS-1、MS-2两个活性较好的LSD1抑制剂。通过进一步的机制研究,发现在重组蛋白水平,化合物MS-1、MS-2通过竞争LSD1底物结合位点进而抑制LSD1活性,且均以快结合慢解离的方式与LSD1重组蛋白相互作用。在细胞水平,化合物MS-1、MS-2通过靶向LSD1发挥抑制MGC-803细胞的EMT过程。此外,初步探索了 MS-1、MS-2对免疫检查点PD-L1的调控,发现化合物MS-1、MS-2处理MGC-803细胞会引起PD-L1表达量的增加。(3)新型联苯类LSD1抑制剂对LSD1重组蛋白及胃癌细胞的抗肿瘤作用研究课题组长期研究LSD1小分子抑制剂的靶向设计与合成,本课题对课题组内的化合物库进行筛选,得到化合物HML-390。HML-390是LSD1的不可逆抑制剂,IC50=68.299±1.834 nM。且与LSD1重组蛋白的亲和力较强,KD=3.338×10-5M。在细胞水平,HML-390能够在温度较高条件下维持LSD1稳定性表明化合物能够与LSD1结合,说明化合物HML-390能够靶向LSD1发挥调控其生物学活性的作用。细胞划痕愈合实验及transwell等实验结果表明,HML-390能够抑制MGC-803细胞的转移、迁移能力。克隆形成实验表明HML-390抑制MGC-803细胞的克隆形成率及克隆集落大小。另外,本课题也检测了化合物HML-390对PD-L1表达量的影响,结果表明,化合物处理MGC-803细胞以后,上调了PD-L1的表达量。综上所述,本课题主要筛选了课题组内小分子化合物库,为LSD1抑制剂的研究者们提供了新的活性骨架。同时探索了部分LSD1抑制剂的抗肿瘤活性,为临床上应用LSD1靶向治疗肿瘤提供了生物学依据。此外,本课题首次探索了在胃癌中LSD1对PD-L1的调控作用,为临床使用LSD1抑制剂提供生物学基础。