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目的:
通过优化裂殖壶菌(Schizochytrium WZU4771)生长的条件使菌体在5L发酵罐中达到最佳的生长水平:同时通过放大实验,对裂殖壶菌在50L发酵罐中的生长情况进行初步的研究。
方法:
1.在无菌操作台中将低温保存的菌种(冷冻管)接入装有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中,并在摇床培养三天(25℃,转速200r/min)进行活化。将活化的菌体按5％的接种量转接到装有100mL种子培养基的500mL锥形瓶中,并在相同条件下进行摇床培养,制备摇瓶种子液。
2.将装有3L的发酵基础培养基5L标准发酵罐灭菌冷却后,按照1096(V/V)的接种量将培养48小时的种子接种到发酵罐中,在初始温度25℃,一定搅拌速度和通气量的条件下,采用间歇流加葡萄糖的方式进行培养,当葡萄糖浓度降至10g/L以下时要补加葡萄糖,每次补糖约30g/L。定时取样测定葡萄糖的浓度和生物量,在每次流加后要留样测油脂含量和DHA含量。通过调节发酵培养基的初始pH值、在线控制发酵过程的pH值、在线控制DO值,探讨pH和D0值对裂殖壶菌生长、积累油脂和DHA的影响。
3.将装有30L的发酵基础培养基的50L发酵罐灭菌冷却后,按照按10％(V/V)的接种量将在5L发酵罐内培养24小时左右的二级种子接种到发酵罐中,在温度25℃,一定搅拌速度和通气量的条件下,采用间歇流加葡萄糖的方式进行培养,当葡萄糖浓度降至10g/L以下时要补加葡萄糖,每次补糖约30g/L。定时取样测定葡萄糖的浓度和生物量,在每次流加后要留样测油脂含量和DHA含量。
4.采用酸热法提取裂殖壶菌菌体的油脂,经甲酯化后用气相色谱法检测菌体DHA含量(内标法,以花生酸为内标物)。
结论:
1.确定摇瓶种子培养时间为48小时,发酵培养基的起始葡萄糖浓度为3％。
2.在装有3L培养基的5L发酵罐中按照10％(V/V)的接种量、培养温度25℃、采用间歇流加葡萄糖的方式培养裂殖壶菌。(1)裂殖壶菌在发酵罐中的培养时间定在60-70小时最为合适。(2)在起始培养基pH6-8范围内,裂殖壶菌的生物量、菌体油脂和DHA含量没有明显变化,发酵基础培养基的自然pH接近6.0,因此采用自然pH培养基发酵。(3)较高溶氧有利于裂殖壶菌的生长,但低溶氧有利于DHA的积累；因此在裂殖壶菌发酵的前期要控制相对较高的溶氧(溶氧值在30％空气饱和度左右),而在发酵的后期就要使溶氧值控制在10％空气饱和度以下。(4)酵母粉的质量对裂殖壶菌的生长与积累DHA由显著影响；(5)在5L发酵罐内采用自然pH值、25℃、葡萄糖间歇流加、OXOID牌酵母粉、后期溶氧保持10％饱和度以下培养,葡萄糖的菌体得率、菌体浓度、油脂浓度、DHA浓度分别为35.02％、51.07 g/L、25.05 g/L、5.16 g/L。
3.二级种子(在5L发酵罐内培养)的适宜菌龄为24小时左右,在装有30L.培养基的50L发酵罐中按照10％的接种量、培养温度25℃、采用间歇流加葡萄糖的方式培养裂殖壶菌,在发酵60-65小时左右生物量、菌体油脂和DHA含量达到最大值,葡萄糖的菌体得率、菌体浓度、油脂浓度、DHA浓度分别68.95％、33.46g/L、12.67 g/L、2.00 g/L。菌体浓度、油脂浓度、DHA浓度明显低于5L发酵罐的发酵结果。