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沙门菌是一种重要的人兽共患致病菌,除危害我国国民健康外,还严重制约我国养禽业的发展。沙门菌能够逃避鸡体免疫和通过亲子代垂直传播的特点决定了种群净化是解决禽沙门菌病最好的方式,但鉴于我国养禽业集约化水平低、饲养管理水平参差不齐、禽沙门菌病多发的现状,在养殖端使用抗生素始终是预防和治疗禽沙门菌病的重要策略。近年来,迫于沙门菌耐药性的迅速增长和国家减抗、限抗的政策要求,我们计划将噬菌体推广到畜禽生产中。在雏鸡生长早期,机体免疫不成熟,肠道菌群发育不完全,很容易感染沙门菌等细菌性疾病。抗生素预防或治疗细菌性感染的机制是抑制致病菌生长、改善肠道菌群。噬菌体作为一种替代抗生素的绿色药物,影响雏鸡早期盲肠菌群发育的研究较少。而雏鸡盲肠微生物的正常建立与促进肠道发育,增强消化功能,增加宿主对环境的抵抗力有关。为证明噬菌体使用的有效性、安全性,本研究评估了噬菌体对感染雏沙门菌雏鸡的治疗效果,重点关注噬菌体如何影响雏鸡盲肠菌群,调节肠道稳态。主要试验结果如下:1噬菌体的分离鉴定本研究收集不同地区养鸡场的污水及粪便,共分离纯化3株沙门菌噬菌体SM5、SM6、SM8,效价分别为10~7、1010、10~8PFU/m L。其中SM6效价高,噬菌斑清晰透亮,最符合烈性噬菌体的标准,透射电镜结果显示,该噬菌体属于长尾噬菌体科。SM6对本实验室保存的104株禽源沙门菌的裂解率达到84.6%。另外,其最佳感染复数是0.001,最高效价达1011 PFU/m L;对温度耐受性良好,60℃高温孵育1 h,效价不变;对碱耐受力强,但对酸的耐受力较弱,能在p H=5-11的情况下正常生存。2噬菌体对鸡白痢治疗效果评估单独口服高剂量的噬菌体不会引起雏鸡体重和血清内毒素水平变化,还观察到P2组中空肠绒毛高度、V/C比值,occludin、ZO-1 m RNA表达水平显著增加,TNF-αm RNA表达水平明显下降,说明合理使用噬菌体能增强雏鸡肠道屏障功能。M组雏鸡呈现感染雏沙门菌的典型症状,闭眼昏睡,羽毛杂乱,伴有腹泻,体重显著低于其他组,荧光定量PCR和16S r RNA高通量测序结果都显示,M组雏鸡盲肠中沙门菌的数量远高于NC组,说明沙门菌定植成功。另外,观察到PT1、PT2、AMXT组中雏鸡发病率下降,症状明显减轻,体重恢复,沙门菌数量明显下降,并且PCR结果显示,随着时间的延长,噬菌体不断降低雏鸡沙门菌的阳性率,说明噬菌体能通过直接降低肠道中沙门菌的数量,抵御雏沙门菌对宿主的侵袭。另外雏沙门菌感染会破坏雏鸡十二指肠、空肠组织形态;显著下调空肠中claudin-1、occludin、ZO-1的表达;提高血清中内毒素的含量;上调IL-1β、TNF-α的m RNA表达水平。噬菌体治疗能缓解雏沙门菌导致的小肠组织形态变化、紧密连接蛋白的基因表达量下调、血清内毒素的升高、炎症因子水平上调。3雏沙门菌和噬菌体对雏鸡盲肠菌群的影响PBS处理组16S r RNA测序结果显示,口服噬菌体不会显著改变群落丰富度和多样性,但盲肠菌群的变化幅度与噬菌体使用时间有关。使用噬菌体的时间越早,盲肠菌群的多样性越低,群落结构差异越大。群落组成分析显示,14日龄雏鸡盲肠中厚壁菌门占绝对优势;在科水平上,毛螺菌科、瘤胃球菌科丰度排名前二。口服噬菌体能显著提高肠球菌属的相对丰度,有降低Ruminococcus＿torques＿group相对丰度的趋势。另外,还观察到P2组双歧杆菌属、罕见小球菌属相对丰度升高,这可能是雏鸡肠道屏障功能增强的原因。Salmonella处理组16S r RNA测序结果显示,试验第3-5d口服噬菌体会显著影响Shannon、Simpson指数,导致群落多样性降低。NMDS分析和群落组成分析也表明,PT1组的菌群结构变化最明显,其中肠球菌属和乳杆菌属成为盲肠中的优势菌属;而PT2组群落结构与NC组最为接近。进一步分析属水平上差异菌群发现,M组Salmonella、Methylophilus、Harryflintia、Halomonas等细菌的相对丰度升高,使用噬菌体治疗能显著降低Salmonella等γ-变形菌纲细菌的相对丰度。结合LEf Se分析,PT1组差异菌群最多,PT2组中差异菌群数量最少,避免在盲肠菌群演替的第一阶段使用噬菌体,在保证治疗效果的同时,会极大程度的降低对其他菌群的影响。综上所述,本研究得出以下结论:1.本研究分离到一株针对沙门菌的噬菌体,其裂解谱较广,增殖效价高,对高温和酸碱有良好的耐受性,有应用到养禽业的潜力。2.噬菌体有效抵御感染表现在降低雏鸡发病率,缓解沙门菌导致的体重下降和肠道屏障功能破坏,大幅降低肠道内沙门菌的数量,不影响雏鸡正常菌群。3.口服噬菌体增强雏鸡的肠道屏障功能,可能与其诱导的肠道菌群变化相关;噬菌体导致的菌群变化程度与使用噬菌体时雏鸡的日龄有关。另外,噬菌体协助鸡体抵御雏沙门菌的机制可能与:直接裂解雏鸡体内的雏沙门菌和调控盲肠菌群两种方式有关。