研究背景2020年全球癌症统计数据表明,胃癌在世界范围内仍是第五大常见的癌症,也是仅次于肺癌、结直肠癌和肝癌导致死亡的第四大癌症。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是导致胃癌的一级危险因素,中国胃癌高发区的成人幽门螺杆菌感染率在60%以上。由于胃癌早期症状不明显,多数患者确诊时已是晚期,此时药物治疗成为主要手段。传统的化疗药物疗效有限而且副作用大,从而导致胃癌患者的五年生存率很低。因此揭示胃癌发生发展的机制,开发胃癌治疗的靶向药物;建立稳健的胃癌预后模型,指导临床用药对于延长胃癌患者的生存期有重要意义。表观遗传调控方式在胃癌进展过程中发挥重要的作用。通过对表观遗传学修饰的研究,探究胃癌发生发展的机制,可以为疾病早期干预和晚期治疗提供理论支持。由于表观遗传学修饰具有可逆性,所以表观遗传学分子有可能成为胃癌治疗的潜在靶点。组蛋白去甲基化修饰作为一种重要的表观修饰方式一直是肿瘤研究的热点。通过数据分析,我们发现组蛋白去甲基化KDM6B在胃癌样本中高表达,而且胃癌患者中KDM6B的高表达与病人不良预后相关。研究报道KDM6B的异常表达可以促进或抑制不同肿瘤的进展,然而KDM6B在胃癌进展中的功能及调控机制尚未阐明。胃癌的预后预测对于胃癌治疗方案的制定和治疗效果的评价有重要的意义。目前,AJCC（美国癌症联合委员会）TNM分期仍是胃癌最基本的预后预测工具,高分期提示预后不良。然而,由于胃癌及患者的异质性,同一 TNM分期的患者可能有不同的预后。因此,有必要根据患者的自身特点并综合考虑其它重要因素,进行个性化预测。近年来,生物信息学理论和方法迅速发展,由基因芯片和高通量测序产生的生物大数据指数式增加。利用生物信息学的分析方法和分析软件分析生物大数据,在制定个性化治疗方案和建立准确的预后预测模型方面具有巨大优势,应用前景广阔。研究目的（一）解析组蛋白去甲基化酶KDM6B在胃癌发生发展中的作用与机制。（二）基于胃癌公开数据,利用生物信息学方法构建一个能预测胃癌预后的多因素Cox风险模型。方法和结果（一）KDM6B通过其酶活性促使CXCR4启动子区附近H3K27me3发生去甲基化,进而上调CXCR4的表达,促进胃癌细胞增殖和转移;幽门螺杆菌可以诱导KDM6B的表达。1.通过对胃癌公共数据进行WGCNA（权重基因共表达网络分析）分析,发现有三个基因模块与肿瘤分期正相关。2.我们将上述结果中与肿瘤分期正相关的三个模块里共1258个基因与451个表观遗传基因取交集共得到8个基因。在GEPIA数据库中对这8个基因进行差异表达分析,发现与正常组织相比,ARID1A、KDM6B在胃癌组织中高表达。通过比较Kaplan-Meierplotter生存曲线,发现KDM6B对于胃癌患者有更高的预后价值。3.在GEO数据集GSE13911和GSE19826中分析,发现KDM6B在胃癌样本中表达明显上调。在数据集GSE13911和GSE19826中绘制ROC（受试者工作曲线）曲线,结果发现,基于KDM6B的表达可以特异性的区分胃癌组织和癌旁组织。实时定量PCR检测结果发现,胃癌组织中KDM6B mRNA表达水平显著高于癌旁组织。Western blot实验和免疫组化检测均发现胃癌样本中KDM6B蛋白表达水平显著高于癌旁组织。4.通过体外克隆形成和EdU实验发现,敲低KDM6B或加入KDM6B酶活性抑制剂GSK-J4可以抑制胃癌细胞的增殖,过表达KDM6B可以促进胃癌细胞的增殖,但过表达酶活性突变的KDM6B没有这种作用。裸鼠皮下成瘤实验发现,敲低KDM6B可以在体内抑制胃癌细胞的增殖。5.Tanswell和划痕实验证明,敲低KDM6B或加入KDM6B酶活性抑制剂GSK-J4可以抑制胃癌细胞的转移,过表达KDM6B可以促进胃癌细胞的转移,但过表达酶活性突变的KDM6B没有这种作用。裸鼠尾静脉注射实验结果发现,敲低KDM6B可以在体内抑制胃癌细胞的肺转移和肝转移。Western blot实验发现,敲低KDM6B或加入KDM6B酶活性抑制剂GSK-J4可以下调胃癌细胞间质标记物N-cadherin蛋白的表达,上调上皮标记物E-cadherin和Claudin-1蛋白的表达,过表达KDM6B后,胃癌细胞间质标记物N-cadherin蛋白表达升高,上皮标记物E-cadherin和Claudin-1蛋白表达降低,但过表达酶活性突变的KDM6B没有这种作用。6.为了研究KDM6B在胃癌中发挥功能的具体机制,胃癌细胞敲低KDM6B后,我们进行RNA-Seq,结果发现769个差异表达基因。通路富集分析发现,有多种肿瘤以及与肿瘤发生发展有关的信号通路被富集。通过PPI分析,我们得到差异基因蛋白互作网络。利用MCC对蛋白互作网络评分,我们发现CXCR4可能是受KDM6B调控的下游核心基因。在GEPI数据库中对KDM6B和CXCR4进行相关性分析,结果发现两者mRNA表达水平正相关。RT-qPCR和Western blot检测结果表明,敲低或加入KDM6B抑制剂GSK-J4,均能下调胃癌细胞中CXCR4的表达,过表达KDM6B可以促进CXCR4的表达,但过表达酶活性突变的KDM6B没有这种作用。7.Western blot结果发现,敲低KDM6B或加入其酶活性抑制剂GSK-J4能上调胃癌细胞H3K27me3的蛋白水平。通过WASHU网站发现,CXCR4启动区附近存在H3K27me3的富集区。Chip-qPCR结果表明,与对照组相比,敲低KDM6B可显著提高胃癌细胞中CXCR4启动子区附近H3K27me3的富集水平。8.通过克隆形成回复实验发现,敲低CXCR4可以逆转KDM6B对胃癌细胞增殖能力的促进作用。Transwell回复实验发现,干扰CXCR4可以逆转KDM6B对胃癌细胞转移能力的促进作用。9.RT-qPCR和Western blot检测结果表明,幽门螺杆菌感染可促进胃癌细胞中KDM6B mRNA和蛋白的表达。（二）基于公共数据,利用生物信息学的方法构建了7基因簇风险模型,并在多个数据集中进行了验证,进一步结合年龄分期构建了列线图,并进行性能评估。1.使用胃癌公开数据进行WGCNA（权重基因共表达网络分析）分析发现,深蓝色基因模块与肿瘤分期正相关。通过PPI分析和MCOD评分,我们得到两个基因子网络。通过深蓝色模块中MM大于0.8且GS大于0.2的基因与子网络1基因取交集,得到9个核心基因。利用GSE27411和TCGA数据集进行分析发现,与幽门螺杆菌阴性样本比较,9个核心基因在幽门螺杆菌阳性的胃炎和胃癌样本中高表达。2.基于9个核心基因的表达,我们将胃癌样本分成两个组。通过生存曲线比较发现,与组1相比,组2患者预后不利。通过比较两组患者的临床特征发现,组1样本主要为代谢型和增值型,组2样本为浸润型。通过比较肿瘤微环境发现,组2样本中有更多的免疫细胞和基质细胞浸润,组1样本有更高的肿瘤纯度。GSVA分析发现,与免疫反应、信号转导、幽门螺杆菌感染、上皮-间质转化（EMT）、缺氧和肿瘤进展通路相关的多种信号通路在组2样本中富集。3.对两组样本进行基因表达差异分析,通过对差异表达基因进行单变量Cox回归分析、LASSO回归分析和多变量Cox回归分析,得到7个基因:APOD、APOE、CCDC80、CTHRC1、FERMT2、GXYLT2 和 SMPX。基于 7 个基因的表达和生存数据,我们构建了一个7基因多变量Cox预后风险模型,并得到风险分数。生存和ROC曲线显示,在训练集和多个验证集中,高风险组患者预后差,风险评分能较准确的预测患者生存状态。在训练集和多个验证中进行单变量Cox回归分析发现,风险评分均具有显著的预后意义。多变量Cox回归分析结果显示,风险评分可以作为一个独立的预后因素。4.通过整合年龄、分期和风险评分,我们构建了一个列线图。校准图、ROC曲线图评估发现,列线图在1、3、5年均显示出良好的预测性能。通过与以前报道过的三种胃癌预后模型比较发现,我们的列线图表现出更优的预测能力。通过实时定量PCR检测16对胃癌和癌旁临床组织中7个基因的表达水平,结果显示,APOE、CTHRC1和GXYLT2在胃癌组织中高表达。利用Kaplan-Meierplotter数据库中绘制生存曲线发现,7个基因都有明显的预后价值。5.通过分析患者风险分数和临床特征发现,肿瘤分期高的患者风险评分也越高,混合型和弥漫型胃癌患者的风险评分更高,淋巴管浸润的患者风险评分高,间质表型（MP）患者的风险得分高于上皮表型（EP）的患者,发生远处转移（M1）患者的风险得分高于没有转移（M0）的患者。GSEA分析结果发现,低风险组主要富集到与DNA复制、碱基切除和同源重组等相关的通路,高风险组主要富集到血管生成、上皮间质化和肿瘤转移等相关的通路。相关性分析发现,风险分数与间质化分子CDH2、SNAIL1、SNAIL2和VIM的表达呈正相关,与上皮分子CDH1的表达呈负相关。6.比较高低两组样本肿瘤微环境发现,高风险组样本免疫评分、基质评分高于低风险组,肿瘤纯度与风险评分负相关。卡方分析结果表明,高风险组中高免疫患者比例高,而低风险组中低免疫患者比例高。比较高低风险组样本之间29个免疫标签评分差异,发现大多数免疫标签,如免疫反应相关标签、CD8+T细胞、NK细胞、免疫检查点、TILs和IFN（干扰素）反应在高风险组样本中评分更高。通过比较免疫检查点分子表达水平发现,高风险组样本中免疫检查点分子的表达水平高于低风险组。通过分析高低风险组样本差异基因,我们利用CMap数据库得到9个有治疗高风险组患者的潜力药物。研究结论（一）通过本部分研究我们发现,KDM6B在胃癌中表达上调,且高表达胃癌患者预后不利;KDM6可以通过H3K27me3去甲基化酶活性转录调控下游靶基因CXCR4的表达,从而促进胃癌的发生和发展。我们的研究成果可以为开发治疗胃癌的新靶点药物提供实验支持。（二）在本部分我们利用胃癌公共数据,构建了一个与肿瘤进展有关的7基因风险模型。通过风险模型结合临床因素构建的列线图,可以在临床上用来预测胃癌患者的预后以便指导临床用药。