终末期肾病(ESRD)是各种慢性肾脏疾病持续不愈、进行性发展的最终结局。不论肾脏病的原始病因如何，其基础病变是否静止，肾脏都将缓慢、持续、不可逆地向着终末期肾功能衰竭进展。迄今为止诸多的研究表明，以基质蛋白合成增多、降解减少所造成的细胞外基质的大量堆积导致的进行性肾小管间质纤维化是各种晚期肾脏病的共同特征，慢性肾脏疾病肾功能的恶化进程取决于肾小管间质纤维化的程度和范围。因此积极探讨慢性肾小管间质纤维化的机制，寻找积极有效的防治措施，延缓、阻滞肾小管间质纤维化的发生发展已成为国际肾脏病界的研究热点之一。 细胞外基质的大量堆积被普遍认为是导致肾小管间质纤维化的重要步骤。究其来源，肾间质中的成纤维细胞、肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞及炎症浸润细胞都可能参与分泌。在这些细胞类型中，肌成纤维细胞的中心地位已经被广泛接受。肌成纤维细胞是一种特殊类型的细胞，兼具成纤维细胞和平滑肌细胞的特征，在正常肾脏中处于静止状态，散在分布于肾间质中，病理状态下它们快速增殖，合成并分泌胶原，促进组织纤维化；其是成纤维细胞的一个亚类，表达间充质细胞标记物α-SMA(α-smooth muscle actin)。它的出现被认为是肾小管间质纤维化进展过程中的一个关键步骤，追溯肌成纤维细胞来源，越来越多的研究证实存在肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的逆向分化(EMT)。EMT是肾脏小管细胞丢失上皮细胞表型，获得间叶细胞特征的过程，被认为是胚胎时期间充质细胞——上皮细胞分化(MET)的逆向分化过程。胚胎时期间充质细胞一上皮细胞间的表型转化涉及了一系列参与、影响肾小管上皮细胞发育基因的开启和关闭。我们推测，肾小管上皮细胞在受到损伤刺激后向间充质细胞逆向分化的过程中，同样涉及了这一系列参与、影响肾小管上皮细胞发育基因的启动和表达，使得细胞的转型得以完成，因此，我们选择了这一系列基因中的成员Pax2进行研究。Pax2是泌尿生殖系统发育的早期调控基因，属于在进化上高度保守的PairedBox Gene(PAX)转录因子家族成员，对肾小管上皮细胞分化及肾脏发育起着重要的调控作用，启动胚胎肾发育时期间充质细胞一上皮细胞分化(MET)的分化过程。病理状态下可能启动上皮细胞一间充质细胞(EMT)的转型。但：Pax2并非是独立存在、独立发挥作用的。本课题组的前期研究的WT1也是诱导肾脏胚胎发育过程中间充质细胞-肾小管上皮细胞分化的关键基因之一，并与Pax2相互作用。因此我们认为，在控制、调节肾小管上皮细胞一肌纤维母细胞间的逆向分化过程中，应该有一组基因群的参与，它们在特定信号传导机制的调控下，有序地开启和关闭，执行细胞内部地一系列功能活动。 研究表明局部或循环中的细胞因子在肾小管上皮细胞发生逆向分化的过程中发挥着重要的作用。肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin-System，RAS)是胚胎期肾脏发育的过程中的重要的调控因子。AngⅡ作为RAS系统中最主要的血管活性肽，可引起细胞肥大并促进基质合成，在多种肾病中被激活。在肾脏纤维化的早期阶段，RAS激活的成纤维细胞和肾小管上皮细胞在肾脏疾病持续、不可逆性发展中发挥重要作用。 然而我们对急性缺血再灌注损伤动物模型的研究表明，肾小管细胞也可发生EMT，逆向分化为肌成纤维细胞，其对受损的肾小管上皮细胞进行再生修复，此时肾脏并不发生纤维化。因而我们认为逆向分化TEC的命运尚有这样一种可能：即肾小管上皮细胞转化可能转化为组织干细胞对损伤组织进行修复。 CD133分子是组织干细胞的一个重要的表面标志，研究发现，肾脏中CD133+细胞代表了一个多能的成体组织固有的干细胞群体，可修复损伤的肾小管。肾脏内已分化细胞的增殖及逆向分化在肾脏受损后的修复重建过程中发挥着比骨髓干细胞更重要的作用。对逆向分化细胞是否具有干细胞潜能的研究，将有助于我们深刻地认识肾小管上皮细胞逆向分化的意义、细胞分化后的命运以及逆向分化后细胞对受损组织的积极或消极修复作用。 为此，在本研究中，我们重点探究了成年肾小管上皮细胞受慢性损伤刺激时，发生逆向分化过程中的基因的序列表达和调控；逆向分化发生的可能机制；以及逆向分化后的肾小管上皮细胞生物学行为及命运，从而进一步证实慢性损伤时成年肾小管上皮细胞逆向分化发生的精确机制及其意义。 我们假设：(1)在慢性肾脏疾病进程中，由于特定病理损伤因素的作用，可能激发启动了部分肾小管上皮细胞内以WT1和：Pax2为代表的基因序列，以控制肾小管上皮细胞的逆向分化过程，发生由上皮细胞向间充质细胞的逆向分化的转变。(2)受损局部的炎性因子(如局部RAS)可能对肾小管上皮细胞的逆向分化起诱导作用，参与其发生机制。(3)发生逆向分化的肾小管上皮细胞可能具有不同的生物学行为，除了我们以前实验已证实的致纤维化作用以外；其还可能受不同信号的调控获得组织干细胞样的增殖分化潜能，旨在参与肾脏损伤的修复过程。 为此，我们建立了慢性肾功能衰竭动物模型及细胞模型，用分子生物学、免疫化学等方法观察了在肾脏慢性损伤时，肾小管上皮细胞逆向分化过程中，控制胚胎分化发育的关键基因WT1、Pax2等基因的序列表达及调控，试图探讨在慢性肾功能衰竭肾脏病理改变过程中WT1、Pax2基因重新启动对成年肾小管上皮细胞逆向分化的影响、分子学机制及相互联系，肾脏局部炎性因子对EMT的影响。并进一步研究了经EMT后的肾小管上皮细胞的功能和命运，即：①肾小管上皮细胞发生EMT由上皮细胞转化为向具有增殖分化潜能的间充质细胞，在某些信号的介导下，这些获得分化潜能的肾小管上皮细胞群可向肾小管上皮细胞方向分化，积极参与肾小管上皮细胞的再生修复：②肾小管上皮细胞发生：EMT由上皮细胞转化为向具有增殖分化潜能的间充质细胞，在另类信号的介导下，向纤维母细胞方向分化，通过分泌细胞外基质、形成纤维结缔组织起到消极的修复作用，从而导致肾小管间质纤维化的发生发展。 具体研究方法如下： 1．Pax2与胚胎/初生期肾脏发育之间关系的研究目的：观察肾脏发育期间即胚胎期和新生期肾脏中Pax2的表达消涨情况，探讨Pax2在肾脏发育过程中的可能作用，为下一步实验做准备。 小结：Pax2的表达与肾脏发育成熟时间之间的相关性提示了Pax2在肾脏胚胎发育中的重要作用。 2． Pax2与5/6肾部分切除致慢性肾损伤之间关系的研究.(1)5/6肾部分切除致慢性肾损伤时Pax2重新启动与肾小管上皮细胞逆向分化的关系目的：观察控制肾小管上皮细胞胚胎发育时期的关键基因-Pax2在慢性肾损伤过程中是否重新表达及其表达情况，探讨Pax2和肾小管上皮细胞逆向分化以及肾脏进行性纤维化之间可能的内在联系。小结：胚胎发育基因Pax2在慢性肾损伤中重新一过性开放，可能是促使肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞逆向分化、肾小管间质进行性纤维化的内在启动机制；逆向分化后的肾小管上皮细胞表达间充质细胞的标志α-SMA。Pax2并非独立作用的，其与WT1等一系列基因是相互作用、相互影响的，Pax2的双峰表达模式证明了这一观点。 (2)慢性肾损伤肾小管上皮细胞逆向分化机制研究——肾脏局部RAS与Pax2之间的关系目的：观察体外培养NRK-52E细胞模型在局部RAS变化时，肾小管上皮细胞内Pax2的表达和变化情况。探讨肾脏局部RAS变化与Pax2基因之间的内在联系。小结：RAS与：EMT有明确关联，在体外RAS能够激发。肾小管上皮细胞发生逆向分化，表达肾脏胚胎发育基因Pax2，体外启动肾小管上皮细胞发生逆向分化。 3、肾小管上皮细胞逆向分化与干细胞潜能的获得目的：体外建立局部不同浓度的RAS环境，观察PETC细胞(NRK-52E)CD133分子的表达和变化情况及其与Pax2的关系。 小结：逆向分化的过程是肾小管上皮细胞转化为组织干细胞对组织损伤进行修复的可能途径，上皮细胞通过逆向分化获得干细胞的潜能，表达肾组织干细胞标志CD133分子。 结论：Pax2是控制胚胎肾小管上皮细胞分化、发育的关键基因，在肾小管上皮细胞发育成熟后，Pax2表达几近消失。肾脏受损后，Pax2在成年鼠肾小管上皮细胞中又可出现短暂重新表达，表现出开放-关闭-重新开放的表达模式，可能是肾小管上皮细胞发生逆向分化以及肾间质进行性纤维化的内在启动机制。Pax2并非独立作用的，其与WT1等一系列基因是相互作用、相互影响的。RAS作为胚胎期肾脏发育的过程中的重要的调控因子，能够刺激肾小管上皮细胞发生EMT并且表达Pax2和肾脏干细胞标志CD133。发生逆向分化的肾小管上皮细胞获得干细胞潜能，对受损的肾小管上皮细胞进行修复。而由于特定的肾脏局部环境作用，逆向分化的肾小管上皮细胞只能起到消极的修复作用，导致肾小管间质的纤维化。